细菌鞭毛染色培养条件的研究

王 燕 曾 燏

1.川北医学院病原生物与免疫学教学实验中心，四川南充637000；2.西华师范大学生命科学院，四川南充637002

细菌鞭毛染色培养条件的研究

王 燕1曾 燏2

1.川北医学院病原生物与免疫学教学实验中心，四川南充637000；2.西华师范大学生命科学院，四川南充637002

目的比较细菌在不同培养基和不同菌龄条件下鞭毛的染色效果，探索细菌鞭毛染色形态鉴定理想的培育基和培育时间。方法①将普通变形杆菌分别接种在肉汤培养基、琼脂培养基、血琼脂培养基3种不同培养基内，37℃培养18 h后，染色镜检，选择取出染色效果最好的理想培养基；②将普通变形杆菌接种到理想培养基上分别培育8、12、18、24 h不同时间后，染色镜检，选择出细菌鞭毛染色效果最好的培育时间。结果①血琼脂中培养的细菌鞭毛结构清晰、形态完整、背景干净，镜检效果最好；②12～18 h菌龄的细菌菌体中等大小，鞭毛清晰完整，镜检效果好。结论血琼脂是鞭毛染色教学和形态鉴定理想的培养基；12～18 h是细菌在血琼脂培养基中的最佳生长时间。

鞭毛染色；培养基和培养时间；镀银染色；普通变形杆菌

细菌鞭毛是指存在于细菌细胞壁外的呈波浪弯曲的细长丝状物，是细菌的运动器官。细菌鞭毛在不同细菌中的着生位置和数量是不一样的，是细菌种类鉴定和分类的重要依据之一[1-4]。细菌的鞭毛非常纤细，长5～20μm，直径仅10～20 nm，小于光学显微镜的0.2μm的分辨率，因此，鞭毛需经过增粗直径后再染色才能在光学显微镜下观察[5]。鞭毛的染色效果与细菌的培养条件和培养基的类型密切相关，如刘少有等[6]发现嗜肺军团菌在BCYE培养基上生长的鞭毛较NYE培养基中数量多、生长好；谢文熙[7]研究结果表明，8～12 h为细菌鞭毛染色的最佳观察时间。

普通变形杆菌（proteus vulgaris），广泛分布于自然界，为周鞭毛菌，易于观察，是细菌鞭毛教学和实验的理想菌种之一。鞭毛染色步骤繁琐且结果不稳定，不同的培养基和培养条件对细菌鞭毛的染色效果影响很大，如何选择合适的培养基和培养条件是细菌鞭毛形态学研究的热点问题之一[8-11]。同时由于操作过程复杂，影响因素多，成功率偏低，使得鞭毛染色在基础医学教学中往往较难取得预期的效果。因此，本研究以普通变形杆菌为菌种，通过常规染色方法（镀银染色法）来比较普通变形杆菌在不同培养基（基础肉汤培养基、普通琼脂培养基、血琼脂培养）和不同培育时间（8、12、18、24 h）下的鞭毛染色效果，探讨适宜普通变形杆菌鞭毛培育的最佳条件（培养基和培育时间），以提高鞭毛染色的成功率，从而更好地服务于基础医学的实验教学。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种为普通变形杆菌，保存于川北医学院病原生物与免疫学教学实验中心。实验中所用的试剂：肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉购于杭州天和微生物试剂有限公司；NaCl、FeCl3购于成都科龙化工试剂厂；硝酸银购于天津市博迪化工有限公司；兔血来源于川北医学院动物中心；培养箱购于上海精宏实验设备有限公司（型号为SHP-250）。

1.2 培养基[12]

1.2.1 基础肉汤培养基于1000 mL蒸馏水中加入固体物质，包括3.0 g肉浸膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，1000 ml蒸馏水，混合加热溶解；校正pH至7.4～7.6，煮沸3～5 min，用滤纸过滤；分装于适当试管内，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，置阴暗处贮存备用。

1.2.2 基础琼脂培养基于基础肉汤培养基中加入15%的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20 min后倒入平板上冷却待用。

1.2.3 血琼脂培养基将已灭菌的普通琼脂培养基加热融化，待其冷却至50℃左右，在无菌条件下加入脱纤维兔血5%～10%，轻摇匀（勿使有气泡）后倒入平板上冷却待用。

1.3 菌种

从菌种库取出普通变形杆菌，采用点接法将细菌接种于基础培养基平板上，放入37℃恒温培养箱里连续培养18～24 h，后再转接于另一新鲜平板培养基中继续培育，如此重复培育3代（次）后备用。

1.4 染液制作

媒染剂A[13]：3.0 g FeCl3·6H2O，溶于0.01 mol/L的HCl溶液100 mL中，室温存放，长期稳定。

媒染剂B[13]：单宁酸15.0 g溶解于100 mL蒸馏水中，加入37%甲醛1.0 mL。室温存放，长期稳定。

银染液C[14]：AgNO35.0 g溶于100 mL蒸馏水，取出10.0 mL备用，向余下的90 mL硝酸银溶液缓慢滴加浓氨水，边加边摇动，直至形成沉淀完全溶解重新形成澄清液为止，再将备用的AgNO3溶液缓慢回滴，直至形成稳定薄雾状溶液。

1.5 载玻片处理

将新载玻片放入洗衣粉水清洁液中煮沸10 min，取出冷却后用自来水冲洗干净，再用清洁液浸泡煮沸10 min，自来水冲洗干净。使用前放入95%酒精浸泡24 h，用时取出用纱布擦干。

1.6 染色方法

1.6.1 细菌培养①将传代后的普通变形杆菌分别以液体培养基接种法接种于肉汤管，点接法接种于基础琼脂平板和点接法接种于血琼脂平板内，37℃恒温培养18 h，经染色镜检后，选取染色效果最好的培养基。②将传代的普通变形杆菌接种于染色效果最好的培养基上（随机接种3份），分别在37℃恒温培养箱内培养8、12、18、24 h后染色镜检，确定染色效果最好的培育时间。

1.6.2 制片于处理过的载玻片一端滴加2～3滴蒸馏水，用接种环以无菌操作法取菌落边缘细菌一环，悬于蒸馏水中，待水滴稍变浑浊后立即移开接种环，静置5 min让鞭毛舒张开来，稍倾斜玻片，使菌液从玻片的一端流向另一端，放置台上，自然干燥。

1.6.3 染色取A液1 mL滴入带有塞的试管内，再加入B液1 mL，充分混合，用酒精灯火焰微热20 s，稍冷却后取适量混合液滴于制片好的菌膜上并完全覆盖菌膜染50 s，用蒸馏水冲洗干净。因A、B混合物不稳定，故要尽快使用，否则影响染色效果。

滴加银染液C覆盖住菌膜，加热至蒸气微冒（约持续20 s），用蒸馏水冲洗干净，并保证染液不被蒸干。

1.7 镜检观察

用吸水纸吸干已染色好的载玻片，后在显微镜（油镜）下镜检、观察、拍照。为了避免实验误差，每次实验均在同等条件下重复3次，不同批次所得的染色玻片均由同一人进行镜检观察。

2 结果

2.1 培养基对细菌鞭毛染色效果的影响

分别比较接种于3种不同培育基（普通肉汤培养基、普通琼脂培养基和普通血琼脂培养基）上普通变形杆菌鞭毛的镜检效果可知，在血琼脂培养基中培养的细菌鞭毛伸展性好，菌体形态完整，粗细均匀，总体效果好，而普通肉汤培养基和普通琼脂培养基培养的鞭毛较稀疏，结果则相对较差。

2.2 菌种培育时间对细菌鞭毛染色效果的影响

培养时间长短对普通变形杆菌的鞭毛生长也有较大影响。将普通变形杆菌接种在培育效果较好的血琼脂培养基中培育，分别培养8、12、18、24 h，比较不同的培养时间下普通变形杆菌的镜下效果：8 h菌龄的细菌菌体粗大且很长、鞭毛周身如毛绒状，这可能是变形杆菌菌体还处于分裂繁殖阶段，而鞭毛也正在发育；12 h菌龄细菌菌体中等大小，鞭毛清晰完整，效果好；18 h菌龄的细菌菌体较短小，鞭毛周身且完整，易于观察，24 h菌龄细菌菌体短小，鞭毛比较稀疏，有些菌体的鞭毛已脱落。因此选用12～18 h菌龄的细菌做鞭毛染色效果好，易于观察。见图1。

图1 培养不同时间的细菌鞭毛染色图（1000×）

3 讨论

鞭毛染色步骤较多、过程复杂，影响其染色效果的因子较多，且难以量化，使得细菌的鞭毛染色历来被认为是难点多、不易掌握的一种方法。笔者结合本研究结果及工作实践中的多次试验，不断总结，就如何提高细菌鞭毛染色效果提出以下建议和注意事项：①载玻片要处理干净，不能有油渍，否则细菌游动不开堆积在一起，无法进行观察。较好的玻片标准：当滴加一滴蒸馏水在上面时，水滴能快速均匀的扩散开来。②在平板上接种细菌采用点接法，一般一个平板点接3处。③培养时间要掌握好，一般培养时间控制在12～18 h内，若时间太短，刚形成的鞭毛较小，且菌体较粗大不利于观察鞭毛，若时间太长则鞭毛易脱落也不利于观察。④制片时，应选取菌落边缘的幼龄菌，且接种环应先放入载玻片上的蒸馏水中静置待用，当细菌游动开来再拿出，切忌用涂抹法制片，否则易造成鞭毛脱落。⑤制得的片子只能自然干燥，不能加热固定，否则细菌变形后鞭毛脱落不利于观察。⑥染液A、B混合时要掌握好时间，且混合后尽快使用，不可久置，特别注意每一步染色后均需用蒸馏水进行充分地漂洗，否则背景杂质颗粒，不利于观察。⑦用银染液染色时要加热，且加热过程中应及时添加染液，保证染液不干涸。

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The study of culture conditions in bacterial flagella staining

WANG Yan1ZENG Yu2
1.Experimental Teaching Center for Pathogenic Subject,North Sichuan Medical University,Sichuan Province,Nanchong 637000,China;2.College of Life Science,China West Normal University,Sichuan Province,Nanchong 637002,China

ObjectiveTo compare the bacterial flagella staining effect in different medium and different age conditions, and to explore the best medium and incubation time for bacterial flagella staining teaching and morphological identification.Methods①The Proteus vulgaris were inoculated in broth medium,agar medium,and blood agar medium 3 different media,cultured for 18 hours based on 37℃,then stained and checked with the microscopic,and the best medium was chosen.②The Proteus vulgaris were inoculated into the ideal medium culture for 8,12,18,24 h respectively,then stained and checked with microscopic,and the best time of cultivation in flagella staining effect was selected.Results①The bacterial growth on blood agar had good results,with complete structure,clear morphological and clean background.②12-18 hours age had the best effect with clear and complete flagella.ConclusionThe blood agar is the best medium for bacterial flagella staining teaching and morphological identification.Meanwhile,the best time of bacteria in culture is 12-18 hours.

Flagella staining;Media and incubation time;Silver staining;Proteus vulgaris

R446

A

1673-7210（2014）03（b）-0035-03

2013-12-01本文编辑：任念）

国家自然科学基金项目（编号51309196）。

王燕（1981-），女，四川眉山人，硕士，主要从事病原生物实验教学和科研工作。

曾燏（1981-），男，湖北武穴人，博士，副教授，主要从事生物学教学和科研工作。