YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达部位及意义

刘小满，谭志军

YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达部位及意义

刘小满1，谭志军2

目的：探索YB-1蛋白在结肠癌组织、正常结肠组织、结肠癌细胞株、正常结肠细胞株中的表达量及其与结肠癌患者临床病理的关系。方法：采用免疫组化检测YB-1蛋白在103例结肠癌组织及相应癌旁组织、30例正常结肠组织中的表达情况；采用Western blot法检测核移位YB-1蛋白在结肠癌组织、相应癌旁组织、正常结肠组织、人结肠腺癌细胞株LS-174T、正常细胞株SW480中的表达。结果：免疫组化结果显示YB-1蛋白主要表达于癌细胞胞浆，其阳性率为（75.73%，78/103），明显高于癌旁组织（37.86%，39/103）及正常组织（30%，9/30），其差异有统计学意义（P＜0.05）。其中37例（35.92%，37/103）结肠癌组织伴有明显核阳性表达，且核阳性表达与结肠癌肿瘤直径大小、有无淋巴结转移、有无远处转移或直接侵犯及癌细胞分化程度相关（P＜0.05）。Western blot检测同样证实核移位YB-1蛋白在结肠癌组织中（0.382±0.095）明显高于癌旁组织（0.251± 0.043）及正常结肠组织（0.238±0.045），其差异有统计学意义（F=21.268，P＜0.05）。核移位YB-1蛋白在LS-174T中的表达（0.548±0.031）明显高于SW480（0.269±0.017），其差异有明显统计学意义（F=64.273，P＜0.05）。结论：YB-1蛋白量的变化与核转移及结肠癌细胞的增殖分化密切相关，有可能成为结肠癌治疗的新靶点。

结肠癌；YB-1蛋白；核移位

Y-box结合蛋白1（YB-1）作为一种多功能蛋白，与转录调节、翻译调控、mRNA选择性剪接、DNA修复、细胞增殖和再生等有关。近年来研究发现YB-1蛋白在多种肿瘤中存在异常表达，并在肿瘤发生、演变、转移、耐药等方面发挥重要作用。目前有关YB-1在结肠癌中表达情况报道较少，本研究旨在探讨YB-1蛋白在结肠癌、腺瘤性息肉、结肠癌细胞株、正常结肠癌细胞系及结肠组织中的表达情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年3月—2013年3月天津市第一中心医院普通外科收治的结肠癌标本110例，所有标本均经病理诊断为结肠腺癌，癌旁肠组织103例为已切除结肠癌，距肿瘤边缘1～5 cm内的无瘤肠组织。48例结肠腺瘤性息肉取自天津市第一中心医院。另外30例正常肠组织取自天津市第一中心医院消化科内镜室结肠镜检查者。所有标本获取均征得患者及家属同意，并通过医院伦理委员会批准。103例结肠癌标本中男性53例，女性50例，肿瘤直径大小1.5～11 cm，平均直径为6.28 cm。病理分期及分型：高分化腺癌9例，中分化腺癌70例（纳入了高中分化腺癌），低分化腺癌24例（纳入了中低分化腺癌）。有淋巴结转移N1 40例，N0 63例，有远处转移或直接侵犯M1 31例，M0 72例。人结肠腺癌细胞株LS-174T购自中科院上海细胞生物研究所细胞库，正常细胞株SW480由我院实验室惠赠。

1.2 主要试剂 兔抗人YB-1多克隆抗体购于Abcam公司（12148），鼠抗人HistoneH1单克隆抗体购于SantaCruz公司（sc-8030）。免疫组化SP试剂盒、DAB试剂盒、HRP标记羊抗鼠二抗均购于北京中衫金桥公司。HRP标记羊抗兔二抗/核蛋白提取试剂盒及ECL发光试剂盒购于碧云天无技术公司。

1.3 免疫组化染色 采用免疫组化SP法，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作，其中YB-1抗体稀释比例为1∶100。免疫组织化学检测结果判定标准：随机选取5个高倍镜视野观察细胞，细胞质和（或）细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞。根据染色程度的不同评分：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；按阳性细胞百分比：≤5%为0分，＞5%至≤25%为1分，＞25%至≤50%为2分，＞50%至≤75%为3分，＞75%为4分。以两者积分的乘积作为评判标准：0分为阴性（-），1到4分为弱阳性（+），≥4分＜6分为阳性（++～+++），≥6分为强阳性（++++）。

1.4 Western blot 提取100 mg组织，匀浆：取对数生长期细胞（数量为1×107个），提取核蛋白，用BAC法测定蛋白质浓度后取100 μg上样。一抗兔抗人YB-1多克隆抗体工作浓度为1∶1000，内参鼠抗人HistoneH1单克隆抗体工作浓度为1∶500，HRP标记羊抗鼠/羊抗兔二抗工作浓度1∶2000，其余同标准的Western blot步骤。所有细胞样本均重复检测5次。1.5 统计学处理 所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。免疫组化结果采用卡方检验，Western blot数据以(±s)表示，采用单因素分析检验，两两比较采用Games-Howell法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达及定位 免疫组化结果显示，在结肠癌组织中YB-1蛋白主要定位于胞浆多呈强阳性表达（75.73%，78/103）。在癌旁组织及正常组织YB-1蛋白表达多呈阴性及弱阳性，少数为阳性表达，且同样定位于胞浆，其阳性率分别为（37.86%，39/103）、（30%，9/30）。结肠癌组织与癌旁组织及正常结肠组织比较其差异有统计学意义（χ2=34.477，χ2=25.530，P＜0.05）。我们同样也发现在78例胞浆阳性的结肠癌组织中，37例样本可见不同程度的核表达（图1）。并且在所有结肠癌组织样本中，核周蛋白染色随着细胞分化程度由高到低，出现逐渐聚集的趋势。实验未发现单独核表达的结肠癌组织样本。

图1 YB-1蛋白免疫组化检测

2.2 YB-1蛋白表达与临床病理指标的关系 单独YB-1蛋白的胞浆表达与患者相应临床参数无明显关系（P＞0.05）。但同时伴有核表达则与肿瘤的大小，有无淋巴结转移及远处转移和（或）直接侵犯相关（P＜0.05）（表1）。尤其在恶性度较高的低分化腺癌的结肠癌组织样本中核表达更为显著，高分化组、中分化组及低分化组相比他们的差异有统计学意义（表2），分别两两比较胞核YB-1蛋白表达：高分化组与中分化相比：χ2=1.084，P＞0.05差异无明显统计学意义；中分化组与低分化组：χ2=14.437，P＜0.05，差异有明显统计学意义；高分化组与低分化组：χ2=9.416，P＜0.05，差异有统计学意义。

2.3 YB-1蛋白核移位在结肠癌组织中表达 采用Western blot半定量检测YB-1核蛋白在结肠癌组织、癌旁组织、正常结肠组织及细胞株中的表达。结果显示核移位的YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达（0.382±0.095）高于癌旁组织（0.251±0.043）及正常结肠组织（0.238±0.045），其差异有统计学意义（F=21.268，P＜0.05）。尽管有41例结肠癌组织在免疫组化实验中核表达阴性，但在Westerbn blot实验中却显示其核移位表达量多高于相应的癌旁组织。核移位YB-1蛋白在结肠癌细胞株LS-174T中的表达量为（0.548±0.031），与正常结肠细胞株SW480的表达（0.269±0.017）相比其差异有明显统计学意义（F=64.273,P＜0.05）（图2）。

表1 YB-1蛋白不同表达部位与结肠癌组织临床参数的关系

表2 YB-1蛋白不同表达部位与结肠癌细胞分化程度的关系

图2 Western blot检测YB-1核蛋白在正常结肠组织、癌旁组织、细胞株及结肠癌组织中的表达

3 讨论

人类的Y-box结合蛋白有dbA、dbB和YB-1蛋白等，但在与肿瘤发生关系上研究较为广泛的仍是YB-1蛋白。YB-1蛋白是DNA-binding蛋白家族成员，分子量为43-kDa，一般分布于细胞的胞浆，当细胞受到抗癌药物、紫外线照射、高温等刺激后，YB-1由胞浆进入细胞核，在细胞核内与靶基因启动子区反向CCAAT位点相结合，从而调控靶基因的转录[1-2]。许多实验研究发现YB-1蛋白对抑癌基因p53起负调节作用，YB-1蛋白可能是作为p53的负调节因子，并且是抑制p53启动子转录的一种特异形式，降低了内生p53的水平，从而降低p53的活性[3-4]。近年来许多研究表明YB-1蛋白在人类前列腺癌[5]、乳腺癌[6-8]、胃癌[9]、白血病[10]、黑色素瘤[11-12]及结肠腺癌[13-14]等肿瘤细胞中过表达，其胞浆的高表达及YB-1蛋白的核移位与肿瘤细胞的增殖分化和细胞耐药方面具有一定的相关性。本研究结果显示：YB-1蛋白主要在结肠癌组织胞浆中高表达，且明显高于癌旁组织及正常组织，其差异是有明显统计学意义的。但与以往的研究YB-1蛋白在非肿瘤组织中呈阴性的结果不同，其在癌旁组织及正常结肠组织中也有一定程度的YB-1表达。表明YB-1蛋白在正常结肠组织中也有一定的生理作用，它在肿瘤的发生及增殖分化过程中同时存在着量的变化和核移位现象。

我们的研究显示：在胞浆中YB-1蛋白高表达的结肠癌组织中，我们发现单独的胞浆高表达与患者的临床参数无明显的相关性，如肿瘤直径的大小、有无淋巴结转移、有无远处转移或直接侵犯及肿瘤细胞的分化程度，它们之间的差异无明显统计学意义。然而在伴有核转移的肿瘤组织中，YB-1蛋白的核转移在肿瘤直径的大小之间的差异是有统计学意义的，在N1与N0之间是有统计学意义的，在M1和M0之间的差异是有统计学意义的，尤其在中分化细胞与低分化细胞之间及高分化细胞与低分化细胞之间差异显著。这一系列的差异表明，YB-1蛋白的核转移与肿瘤细胞增殖分化程度呈一定的正相关性，核转移现象越明显，患者的治疗及预后越差。

进一步的Western blot实验显示：无论免疫组化实验结果阳性还是阴性的结肠癌组织，核移位的YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达量明显高于癌旁组织及正常结肠组织，其差异具有明显统计学意义，而在结肠癌LS-174T细胞株中核移位的YB-1蛋白表达量也明显高于正常的结肠癌SW480细胞株。同样也说明了YB-1蛋白发生的量的变化和核移位现象在结肠癌肿瘤的发生发展及增殖分化过程中具有一定的意义。

既往的实验通过RT-PCR检测YB-1mRNA在肝癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达量，但结果显示其差异没有统计学意义，而YB-1蛋白的表达却是有明显统计学意义的，进而推测YB-1蛋白是通过转录翻译调节后的而产生量及部位的变化，进而引起肿瘤细胞的增殖分化[15]。国外的研究也显示AKT[16]及程序性死亡因子4（PDCD4）[17]对YB-1的表达有明显影响，因此推测YB-1蛋白可能是通过其上游某些因子调节产生功能活性变化如磷酸化、糖链修饰等形成核移位。

综上所述，YB-1蛋白在结肠癌的发生、发展过程中具有一定的促进作用，尤其是其核移位现象对患者预后有明显的指示作用，以YB-1蛋白作为靶点对结肠癌进行干预可能会对肿瘤细胞的增殖分化程度产生影响，进而抑制结肠癌的生长，有效控制病情的发展，因此YB-1可能是结肠癌治疗中的一个新的靶点。

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（收稿：2013-06-20 修回：2013-12-10）

（责任编辑 马东旺 屈振亮）

The Location and Significance of Y-box Protein 1 Expressed in Colorectal Cancer Tissues

LIU xiao-man,TAN zhi-jun.Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin(300070),China

ObjectiveTo explore the expression quantity of YB-1 protein which expressed in colorectal cancer tissue and normal colon tissue,in colon cancer cell lines and normal colonic cell lines,and research the relationship with clinical pathology in colon cancer patients.MethodsWe used immunohistochemical method to detect YB-1 protein in 103 cases of colon cancer tissue and corresponding tissue adjacent to carcinoma,and the expression in 30 cases of normal colon tissue.We used Western blot method to detect the quantity of YB-1 protein expressed inside nucleus in colorectal cancer tissues,tissue adjacent to carcinoma,normal colon tissue, LS-174T cell lines and SW480 cell lines.ResultsImmunohistochemical results showed YB-1 protein expression mainly in cytoplasm,the positive rate in cancer tissues（75.73%，78/103）was more higher than tissue adjacent to carcinoma（37.86%，39/103）and normal tissue（30%，9/30）.The difference was statistical significance（P＜0.05）.37 cases（35.92%，37/103）showed that YB-1 protein expressed inside nucleus,and the positive expression inside nucleus was related to the tumor diameter size,lymph node metastasis,distant metastasis or direct invasion and the degree of cell differentiation(P＜0.05).Western blot results also confirmed that YB-1 protein expressed inside nucleus in cancer tissue(0.382±0.095)were significantly higher than the tissue adjacent to carcinoma(0.251±0.043)and normal tissue(0.238±0.045）.The difference was statistical significance(F=21.268，P＜0.05).And YB-1 protein expressed inside nucleus in LS-174T(0.548±0.031)was significantly higher than sw480 cell lines(0.269±0.017).The difference was statistical significance(F=64.273,P＜0.05).ConclusionThe change of the quantity of YB-1 protein and the translocation is closely related to colon cancer cell proliferation differentiation,and could become the new target to colon cancer treatment.

YB-1 protein；colon cancer；nucleus translocation

R735.3+5

A

1007-6948(2014)02-0127-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.02.006

1.天津医科大学研究生院（天津 300070）

2.天津市第一中心医院胃肠外科（天津 300192）

谭志军,E-mail：zhijuntan2013@163.com