高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量

周贻兵，林野，李磊，王娅芳，刘利亚

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004）

高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量

周贻兵，林野，李磊，王娅芳，刘利亚*

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004）

采用高效液相色谱荧光法测定牛奶中的黄曲霉毒素M1。牛奶中的黄曲霉毒素M1用乙腈超声提取，离心，上清液浓缩后用50mLPBS缓冲液稀释，过免疫亲和层析柱净化，10%甲醇水溶液10mL淋洗柱，2m L甲醇洗脱，洗脱液氮吹干后，用10%乙腈水溶液1mL蜗旋溶解残渣，过0.22μm滤膜，上机测定。对加入乙腈比例、淋洗液及洗脱液进行了优化，结果表明：m牛奶：V乙腈=1：2有效的沉淀蛋白避免了过柱堵塞问题，提高了过柱效率。用10%甲醇水溶液淋洗免疫亲和柱，能有效的去除掉杂质，避免了洗脱液成浑浊现象。该方法的线性范围宽，回收率为89.1%～93.5%，相对标准偏差在6.5%～9.7%之间，检出限为0.01μg/kg，低于1/10现行食品安全国家标准对食品中黄曲霉毒素M1的限量标准，符合检测要求，适用于对牛奶中黄曲霉素素M1的检测。

黄曲霉毒素M1；牛奶；免疫亲和层析柱；高效液相色谱法

黄曲霉毒素M1于1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，主要表现在致癌、致畸、致突变。黄曲霉毒素M1是哺乳动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，被羟基化生成的二次毒性代谢产物，存在于动物分泌的乳汁和产生尿液中。牛乳及其制品是易受黄曲霉毒素M1污染的食品之一，对牛奶中黄曲霉毒素M1准确定量，了解真实污染水平，对维护人群健康具有重要意义。测定黄曲霉毒素M1的方法主要有高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、荧光光度法、酶联免疫法和薄层色谱法等[1-6]。其中高效液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、特异性好，检出限低等优点，但仪器价格昂贵，不易在基层实验室普及，荧光光度法准确性差，是一种半定量方法，难以普及，酶联免疫法为初筛法，易出现假阳性，薄层色谱法所需设备简单，但操作繁琐、灵敏度低等缺点，而高效液相色谱荧光法具有操作简单、灵敏度高，稳定性好等优点，得到广泛的应用。按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黄曲霉M1的测定》中液体奶处理方法，过柱净化过程中易出现堵塞现象，在洗脱过程中，洗脱液浑浊，酸奶pH通常低于免疫亲和柱的使用范围，影响测定结果的准确性。本文选择乙腈为提取剂，有效沉淀蛋白且提取黄曲霉毒素M1更加充分，经离心后得到澄清的提取液，浓缩后用PBS缓冲液稀释后过柱，避免了pH对测定结果的影响，大大提高了过柱效率。

1材料与方法

1.1 仪器与材料

Waters2695型高效液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器，LABOROTA 4001标准型旋转蒸发仪，台式高速冷冻离心机：SiGma公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪，超纯水机：艾科浦；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱：北京华安麦科生物技术有限公司。

黄曲霉毒素M1标准品（0.5μg/mL，PrbioLab公司），水为超纯水，乙腈（色谱纯）。

PBS缓冲液：称取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于900mL超纯水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后加水定容至1 L即可。

1.2 样品的提取与净化

1.2.1 样品的提取

准确称取10.00 g牛奶于50mL离心管中，加入20mL乙腈，超声提取10min，1 0000 r/min离心，取出全部上清液于50mL浓缩瓶中，浓缩使浓缩液体积小于2mL，加入50mLPBS缓冲液摇匀，待净化。

1.2.2 净化

将上述全部溶液过黄曲霉毒素M1免疫亲和柱，用10%甲醇水溶液10mL淋洗，弃去全部流出液，用2mL甲醇洗脱免疫亲和柱，收集全部洗脱液于5mL玻璃试管中，在40℃下氮吹干，用V乙腈∶V水=10∶90的溶液溶解残留物，过0.22μm的滤膜，上机测定。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Waters C18色谱柱（4.6 mm×250 mm× 5μm）；流动相为25%乙腈水溶液，流速1.0mL/min，激发波长365 nm，发射波长：435 nm，进样体积10μL。

2结果

2.1 工作曲线与检出限

将黄曲霉毒素M1标准贮备液稀释成1.0、5.0、 10.0、20.0、40.0 ng/mL标准系列溶液，在1.3色谱条件下进行分析，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标做标准工作曲线，黄曲霉毒素M1的线性回归方程为Y=30 900X+75 400（R2=0.999 9），以3 S/N计算方法的检出限为0.01μg/kg，低于现行食品安全国家标准对食品中黄曲霉毒素M1的限量标准，符合检测要求。

2.2 加标回收率及精密度

向空白牛奶样品中加两个浓度水平的黄曲霉毒素M1，每个添加量做6次平行样，方法的平均回收率在89.1%～93.5%，相对标准偏差在6.5%～9.7%之间（见表1）。

表1 方法的加标回收率及精密度Table1 The recovery and precision of the method

3讨论

3.1 提取条件的优化

乙腈具有沉淀蛋白的作用，本实验考察了m牛奶∶V乙腈=1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 g/mL时蛋白的沉淀效果。实验发现，乙腈比例越高，蛋白的沉淀效果越好，当乙腈与牛奶的比例达到2以上时，牛奶中的蛋白基本沉淀完全，离心后得到比较澄清的溶液。同时比较了不同乙腈比例对阳性牛奶样品中黄曲霉毒素M1提取效率见表2。

表2 不同乙腈比例对阳性牛奶样品中黄曲霉毒素M1测定结果比较Table2 Comparision of determination result of positive sample extracted by different acetonitrile proportion

表2表明，随着乙腈加入量的增加，牛奶样品中黄曲霉毒素M1的提取效率逐渐增加，m牛奶∶V乙腈=1∶0时，即为国标GB5413.37-2010《乳和乳制品中黄曲霉M1的测定》的提取方法，测定结果偏低，当m牛奶∶V乙腈= 1∶2，、1∶3、1∶4时，黄曲霉毒素M1的测定结果非常接近，当乙腈的比例增加时，从而增加了浓缩的时间和处理成本，所以本实验选择m牛奶∶V乙腈=1∶2提取牛奶中的黄曲霉毒素M1。

3.2 淋洗液的选择

提取液过免疫亲和柱后，用10mL纯水冲洗免疫亲和柱，用乙腈或甲醇洗脱后，洗脱液呈乳白色，为了解决此问题，本实验考察了体积比为5%、10%、15%、20%甲醇水溶液10mL淋洗免疫亲和柱。实验结果表明：随着甲醇比例的逐渐增大，洗脱液逐渐变澄清，当甲醇比例达到10%，用乙腈洗脱后溶液基本澄清，但随着甲醇比例的增大，黄曲霉毒素M1的回收率逐渐降低，综合考虑本实验确定淋洗液的比例为10%甲醇水溶液。

3.3 洗脱液的优化

将含有25 ng的黄曲霉毒素M1标准品的PBS溶液加到免疫亲和柱上，过柱后，用10mL 10%甲醇水溶液洗脱杂质，分别用1mL～4mL 80%甲醇水溶液、甲醇、乙腈进行洗脱，收集洗脱液，40℃氮吹干，用10%乙腈水溶液1mL溶解残渣，蜗旋混均，过0.22μm滤膜，上机测定。计算各个上样体积下的回收率，确定最优洗脱条件。

表3 洗脱液及体积对回收率的影响Table3 Effect of different elution solvent and volume on recoveries

从表3可以得出，同种洗脱液，随着洗脱体积的增加，回收率逐渐增加；不同洗脱液在相同洗脱体积下，甲醇和乙腈回收率较好，当使用甲醇或乙腈2mL洗脱黄曲霉毒素M1时，基本洗脱完全，洗脱液的量越大，氮吹耗时越大，甲醇沸点比乙腈低，氮吹消耗的时间越少，综合考虑，本实验选择2mL甲醇为洗脱液。

3.4 pH值对测定结果的影响

按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》中将液体奶处理方法，取一定量的液态奶样品水浴加热到35℃～37℃，离心，收集上清液，过免疫亲和柱。对于酸奶样品，上清液的pH通常在5～6之间，偏离免疫亲和柱的pH使用范围6～8，影响抗原抗体的结合，从而影响测定结果的准确性，使测定结果偏低，所以要用氢氧化钠调节溶液的pH到6～8，再过柱。本文选择磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液，控制溶液的pH在免疫亲和柱的使用范围之内，避免调节溶液pH的过程。

4结论

本文利用乙腈对牛奶样品中的黄曲霉毒素进行提取，有效的沉淀蛋白，避免了过柱堵塞问题，提高了过柱效率，同时乙腈比GB5413.37-2010《乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》中液态乳的处理方法提取牛奶样品中黄曲霉毒素M1更加充分，测定结果更能准确反映牛奶中黄曲霉毒素M1的污染水平。通过回收率实验对淋洗液和洗脱液进行了优化，找出了淋洗液的最佳比例或体积，解决了洗脱液成浑浊的现象。该方法选择了PBS缓冲液为稀释液，有效的控制提取液的酸度在免疫亲和柱适用范围内，避免了单个样品pH调节。该方法的线性范围宽，回收率为89.1%～93.5%，相对标准偏差在6.5%～9.7%之间，检出限为0.01μg/kg，低于1/10现行食品安全国家标准对食品中黄曲霉毒素M1限量标准，符合检测要求，适用于对牛奶中黄曲霉素素M1的检测。

[1]李佐卿,章再婷,谢东华,等.免疫亲和柱高效液相色谱法快速测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2[J].理化检验-化学分册,2005,41(6)：406-408

[2]张鹏,张瑜.高效液相色谱测定牛奶中黄曲霉毒素M1[J].中国卫生检验杂志,2011,11(6)：683

[3]王军淋,蔡增轩,任一平.超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中黄曲霉毒素M1[J].浙江大学学报,2013,39 (2)：191-196

[4]董彬,杨立新,李斌,等.多功能柱净化液液相色谱-质谱-质谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1[J].现代农药,2011,10(4)：38-40

[5]陈敏,王颖,顾其芳,等.SNAPTM检测系统用于筛选牛奶中黄曲霉毒素M1探讨[J].上海预防医学杂志,2004,16(1)：5-6

[6]中华人民共和国卫生部.GB 5413.37-2010食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定[S].中国标准出版社,2010

Determ ination of A flatoxin M1Content in M ilk by High-performance Liquid Chromatography

ZHOU Yi-bing，LINYe，LILei，WANGYa-fang，LIU Li-ya*
（Guizhou Center for Diseases Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China）

Aflatoxin M1in milk were determinated using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.Aflatoxin M1in milk were firstly ultrasonic extracted，centrifuged，concentrated and then purified through immunoaffinity column，using 10%methanol aqueous solution leaching column，dried in nitrogen，volumed by10% acetonitrile aqueous.The ratio of addition acetonitrile，leaching solution and eluent were optimized. The results showed that the results showed that the ratio of the milk sample to acetonitrile was 1 to 2 inmass to volume could effectively precipitateprotein and avoid the column plug. Washing immunoaffinity column with 10 % methanol aqueous can effectivelyremove impurities and avoid the turbid phenomenon of eluent. The recovery of method with widely linearrange was between 89.1 % to 93.5 %，relative standard deviation between 6.5 % to 9.7 % and the detection limit is 0.01μg/kg which was less than1/10of current national food safety standards with limit the quantity of aflatoxin M1. The method can be applied to the determination the content of aflatoxin M1inmilk sample.

aflatoxin M1；milk；immunoaffinity column；high-performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.027

2013-06-26

周贻兵（1985—），男（汉），主管技师，硕士，主要研究领域：食品分析及科研。

*通信作者：刘利亚，男，副主任技师，主要从事于食品分析及科研。