免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中维生素B12

周　黎，余以刚，徐　红，黄焯枝，郭文婷，郭伟鹏

(1华南理工大学，广州　510006；2达能(中国)食品饮料有限公司，广州　510000；3省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广州　510070；4广东省微生物研究所，广州　510070；5广东省微生物分析检测中心，广州　510070)

我国对维生素B12的允许添加量有明确的规定[1-2]，其中饮料类产品的允许添加量为0.6～1.8μg/kg。目前检测维生素B12的方法主要有微生物法[3]、原子吸收法[4]、高效液相色谱法[5]等。其中，微生物法具有工作效率低、操作复杂、成本较高的缺点；原子吸收法由于受基质影响，检测结果不准确，特别是分析含量低的样品；高效液相色谱法具有操作简单、分析准确等优点，但是对于成分复杂、维生素含量低的样品难以进行定量或者定性分析，因此本检测方法采取对高效液相色谱法进行改进，将超高效液相色谱法结合免疫亲和柱对样品进行分析，免疫亲和柱对维生素B12具有较高的选择性，可以对样品维生素B12进行纯化和富集，再经超高效液相色谱法检测样品从而达到分析准确、快速、成本低、操作简单的目的。因此，将免疫亲和柱—超高效液相色谱法运用到成分复杂的饮料中低含量维生素B12的测定具有重大的意义。

1　试验与材料

1.1　仪器与试剂

超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；超声波清洗仪，美国Auto science公司；氮吹仪，中国安谱公司；固相萃取仪，美国CNW公司；超纯水机，美国Millipore公司；维生素B12标准品，99.9%，美国supelco公司；免疫亲和柱，德国拜发公司；甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸，色谱纯，美国CNW公司；乙醇，分析纯，广州化学试剂厂。

1.2　色谱条件

色谱柱HSS T3(2.1mm*75mm，1.8μm，流动相为乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱，柱温35℃，进样量50μL，流速0.6 mL/min，检测波长360nm，洗脱溶剂A相为乙腈，B相为0.1%甲酸，梯度洗脱参数如表1所示。

表1　流动相梯度时间、流速与比例参数

1.3　样品前处理

1.3.1标准溶液的配制维生素B12的标准储备液：称取维生素B12标准品12.0mg溶于5%的乙醇溶液中，用50mL棕色容量瓶定容，混匀后备用。取1mL标准储备液用水稀释至250mL棕色容量瓶中，得到维生素B12的标准中间溶液，再分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL标准中间溶液用水稀释至1 000mL棕色容量瓶中，得到维生素B12的标准溶液，现配现用。

1.3.2免疫亲和柱纯化和富集取25mL维生素饮料进样到真空处理除去缓冲液的免疫亲和柱上，用10mL超纯水淋洗后，真空抽干残留液使亲和柱干燥，再用3mL甲醇溶液反冲洗3次(1次反冲洗用1mL甲醇，共3次)。洗脱时控制为1滴/秒的流速滴到试管中，于60～70℃下用氮气吹干洗脱液，再用0.3mL 0.025%三氟乙酸溶液溶解后得到的溶液用于上机分析。

2　结果与讨论

2.1　前处理净化柱的选择

维生素饮料经免疫亲和柱和Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱纯化后得到的图谱如图1和图2所示。经免疫亲和柱过滤后的图谱相比WatresSep-Pak C18(500mg/6cc)柱过滤后的图谱显示出更好的分离效果，基线平稳且维生素B12出峰无干拢，杂质少。因此，为了对维生素饮料中B12进行定性与定量的分析，选择免疫亲和柱过滤纯化后得到的样品进行后续测定。

图1　维生素饮料经免疫亲和柱过滤后的色谱图

图2　　　　维生素饮料经Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱过滤后的色谱图

2.2　洗脱过程中甲醇量的选择

采用4种洗脱方法进行比较确定洗脱过程中最佳的甲醇量：(1)3mL甲醇洗脱1次；(2)1mL甲醇洗脱1次；(3)分别取3次1mL甲醇洗脱3次；(4)分别取3次1mL甲醇反复来回抽到针筒洗脱3次样品。以上4种洗脱方法速度均为1滴/秒，结果表明，4种洗脱方法的回收率分别为82.1%、65.2%、88.2%、94.3%，故选择第4种方法比较理想。

2.3　洗脱过程中pH的选择

如图3所示，pH7.0条件下经免疫亲和柱富集纯化后样品的维生素B12的含量为0.16μg/100mL左右，而pH3.0条件下经免疫亲和柱富集纯化后样品的维生素B12的含量为0.12μg/100mL左右。结果表明，pH7.0条件下更有利于免疫亲和柱对维生素B12的富集和洗脱，因此选择调整维生素饮料的pH为7.0时进行免疫亲和柱富集和洗脱。

图3　　　　维生素饮料在pH 3.0和pH 7.0条件下经免疫亲和柱洗脱后维生素B12含量的变化情况

2.4　样品的保存与分析

将同一批次生产的维生素饮料分别于20℃、45℃和日光灯条件下存放1个星期，所测得的维生素B12含量结果见表2。不同条件下放置的样品维生素B12的含量依次为20℃>45℃>日光灯，表明光照以及高温会加速维生素B12的分解，因此含有维生素B12的维生素饮料更适合在20℃室温与避光条件下存放。

表2维生素饮料的维生素B12含量单位：μg/L

条件20℃45℃日光灯含量145125113

2.5　线性关系及回收率实验

在浓度为0.4～10μg/L内测定维生素B12的标准曲线，所得的线性回归方程为Y=4 040X-364，相关系数为0.997 00，显示出较好的线性关系。同时对样品进行含量分析，在已知浓度的样品中加入标准溶液重复测定4次，加入值为30.1μg/L时，测定值为28.5μg/L，所得回收率为94.68%，检出限为0.1μg/L，显示出较高的准确性。表明运用免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中低浓度维生素B12的含量是非常准确可靠的。

2.6　系统精密度试验

同一瓶维生素饮料，在1d内连续测定6次，其精密度数据如表3所示，维生素B12的峰面积的RSD为0.65%，精密度良好。说明免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中低浓度维生素B12的含量具有较高的精密度，因此该方法应用到维生素饮料中低浓度维生素B12的含量测定是切实可行的。

表3　样品精密度

3　结论

针对维生素饮料中成分复杂、维生素B12含量很低的特点，直接采用超高效液相色谱法测定维生素B12很难对其进行定性或定量的分析，因此本研究建立了免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中B12的方法。由于免疫亲和柱对维生素B12具有很高的选择性，可以有效的去除杂质的干扰，对维生素B12进行纯化。同时根据仪器与色谱柱的特性，采用乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脱样品，具有较好分离效果，基线稳定。结果表明，采用免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中维生素B12具有较高的回收率为94.68%，且检出限低至0.1μg/mL。因此该检测方法非常适用于成分复杂、结构复杂、维生素含量低的饮料中维生素B12的测定，相比传统的高效液相色谱法具有工作效率高、分析时间短且更准确的优点。◇

[1]吴楠，姜金斗，等.免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定乳粉中B12的含量[J].分析测试学报，2013，32(3)：389-392.

[2]中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2011.

[3]中华人民共和国卫生部.GB 5413.14-2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[4]李妹.紫外吸光光度法测定维生素B12[J].理化检验(化学分册)，2005，41(1)：53-54.

[5]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.217-2008保健食品中维生素B12的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[6]姜学群.高效液相色谱法测定维生素B12片的含量[J].咸宁学院学报(医学版)，2010，24(1)：70-72.

[7]高旭.高效液相色谱法同时测定食品中8种水溶性维生素[J].中国医药指南，2008，6(19)：36-39.