稳定过表达miR-125b对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响

汤锋，杨珏，李润乐，格日力，奚涛**

(1. 青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810016；2. 中国药科大学生物技术中心，江苏 南京 210009；3. 青海大学农牧学院，青海 西宁810016）

稳定过表达miR-125b对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响

汤锋1,2，杨珏2，李润乐1,3，格日力1*，奚涛2**

(1. 青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810016；2. 中国药科大学生物技术中心，江苏 南京 210009；3. 青海大学农牧学院，青海 西宁810016）

目的：通过构建稳定表达miR-125b的真核表达载体以探讨miR-125b对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响。方法：构建重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b并转染MCF-7细胞，通过G418筛选得到稳定过表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b，并结合二维划痕愈伤实验、三维Transwell侵袭小室实验和集落形成实验考察过表达miR-125b对乳腺癌细胞系转移能力的影响。结果：成功获得了稳定过表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b，其在二维和三维水平的迁移能力均明显强于MCF-7细胞，细胞新生克隆数较MCF-7亦有显著提高。结论：miR-125b可使乳腺癌细胞转移能力增强。

miR-125b；真核表达载体；乳腺癌；细胞转移

近年来，乳腺癌发病率呈不断升高的趋势，严重威胁着女性健康。肿瘤细胞转移是影响癌症患者生活质量和导致死亡的重要原因之一[1-2]，深入探索肿瘤的转移机制及寻找转移相关的靶点已成为癌症治疗的重要手段。MicroRNA（miRNA）是一种长度约18～26 bp的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70～90 bp的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，在转录后水平调控靶基因的表达[3]。近来研究表明，miRNA在乳腺癌发生、发展及转移中发挥重要的作用，其中miR-373、miR-21、miR-10b和miR-200c等均与乳腺癌转移密切相关[4-9]。

miR-125b与线虫lin-4具有很强的同源性，位于染色体11q24并在细胞分化中扮演着重要的角色[10-11]。笔者所在课题组的前期研究结果显示，miR-125b与乳腺癌转移呈正相关且在体外具有促进乳腺癌细胞系MCF-7和MDAMB-231迁移、提高其侵袭能力的功能[12]。

构建长效表达miR-125b的载体对于在体内外水平研究miR-125b对细胞转移的影响是至关重要的，这也是现阶段该方面研究的瓶颈。笔者所在课题组首先设计并构建过表达miR-125b的pSilencer 4.1-miR-125b重组质粒，经宿主菌扩增、酶切、测序鉴定后转染乳腺癌MCF-7细胞，通过G418筛选建立稳定表达miR-125b的MCF-7细胞系，并以实时定量PCR（qRT-PCR）进行验证。最后通过细胞划痕-修复实验、侵袭小室及单克隆形成实验考察过表达miR-125b对乳腺癌细胞转移能力的影响。

1 实验材料

乳腺癌细胞系MCF-7和pSilencer 4.1-CMV Expression Vectors为本实验室保存；1640培养基、小牛血清，购自Gibico公司；Transwell 侵袭小室（批号：3401），购自美国Corning公司；Hind Ⅲ限制性内切酶（批号：1060A）、Bam HI限制性内切酶（批号：1010A）、T-4连接酶（批号：2011A）、Taq plus DNA聚合酶（批号：1189A），购自Takara公司；E.coli. DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒（批号：DP103）、DNA片段凝胶回收试剂盒（批号：DP209）、PCR产物纯化试剂盒，购自TIANGEN公司；氨苄青霉素（Amp）、G418，购自上海生物工程技术服务有限责任公司；miR-125b-primer、U6-primer、EzOmicsTM SYBR qPCR Kit，购自百奥迈科生物技术有限公司（Biomics）；Trizol试剂盒（批号：15596-026），购自Invitrogen公司。

2 方法

2.1 PCR扩增获得人miR-125b基因

MCF-7细胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5% CO2、100%湿度条件下培养至70%～90%汇合度时，提取基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增。

根据pre-miR-125b序列设计引物，上游引物P1为5′-CGCGGATCCAACATTGTTGCGCTCCTCTCA-3′； 下 游引 物P2为5′-CCCAAGCTTTTCCAGGATGCAAAAGCAC GA-3′。分别引入了BamH I和HindⅢ酶切位点。以从MCF-7细胞中提取的基因组DNA为模板扩增pre-miR-125b序列。

2.2 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b的构建

将PCR扩增得到的pre-miR-125b基因片段切胶回收后，同时与质粒pSliencer 4.1一起进行BamH I和HindⅢ双酶切，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物，在T4连接酶作用下4 ℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH 5α并保存，利用Amp抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行PCR、酶切验证，进一步通过测序确定序列及连接方向的正确性。

2.3 稳定表达pre-miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b的建立

用0.125%的胰酶消化MCF-7细胞，血球计数板计数，按每孔1.5×103个接种至96孔培养板，次日换含有不同剂量G418（0、50、100、200、400、600和800 mg·L-1）的培养基培养，每个剂量平行6份。每隔3 d更换一次含G418的培养基，培养至第15 d时，通过倒置显微镜观察，选择可以完全杀死MCF-7细胞所需的最小剂量，再略微增加，用作后续转染时的筛选剂量。

转染24 h后将细胞以1∶10比例传代，次日开始用含有适当浓度G418的培养基进行筛选培养，每3 d更换一次培养基，连续筛选3周，然后将获得的细胞克隆扩大培养，通过实时荧光PCR方法检测miR-125b表达情况，留取表达量最高的细胞克隆作为以后研究之用，并将其命名为MCF-7-miR-125b细胞。

2.4 实时PCR检测miR-125b

2.4.1 细胞总RNA的提取 细胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5% CO2、100%湿度条件下培养至70%～90%汇合度时，采用Trizol法提取总RNA，并用Dnase I（Rnase Free）处理以去除可能残余的基因组DNA。取5 μL RNA样品加DEPC-ddH2O定容至1 mL，测定OD260及OD280以判断总RNA的纯度，并以OD260计算总RNA含量。具体操作按Trizol试剂盒说明书（Invitrogen）中步骤进行。

2.4.2 逆转录合成miR-125b-cDNA第一链 在EP管(RNase-free)中加入2 μL总RNA、8 μL DEPC水稀释，各取1 μL U6引物、miR-125b逆转录颈环引物、1 μL MLV逆转录酶、10 μL 5×MLV缓冲液，以DEPC水补至50 μL。逆转录条件为：30 ℃ 10 min，42℃ 1 h，95 ℃ 10 min。

2.4.3 实时PCR检测miR-125b表达水平 选用U6RNA作为内参照，通过实时PCR法对miR-125b进行相对定量。使用EzOmics SYBR qPCR kits试剂盒扩增miR-125b，25 μL反应体系。反应条件为95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，61℃ 30 s (30个循环)，72 ℃ 10 min。以△△Ct法计算miR-125b相对表达差异，计算公式为：其中，“NC”指正常MCF-7细胞系。

2.5 二维水平细胞迁移实验

参考Xu等[13]的实验方法，采用划痕损伤模型分析对比miR-125b表达水平改变后乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231在二维水平迁移能力的差异。具体操作步骤如下：

1）用0.125%胰蛋白酶消化细胞，按每孔6×104个接种到24孔培养板中，于37 ℃、5% CO2条件下培养；

2）次日，待细胞长成均匀单层后，用无菌的10 μL移液器吸头沿孔的中轴线轻轻划过。用37 ℃预热的PBS轻轻洗涤2～3遍，除去漂起的细胞残骸，然后加入37 ℃预热的培养基，放入培养箱中继续培养；

3）培养0.5～1 h待细胞恢复后，以这一时间作为零时间点，分别在0、12和24 h时在倒置显微镜下（50×）观察细胞迁移情况并利用目镜刻度尺测量划痕宽度（S），每孔测量5处（即两端、中点、左1/4处和右1/4处）求平均值，直至细胞完全汇合。每组细胞均设3个平行孔。

2.6 Transwell小室侵袭实验

参考Chen等[14]的实验方法，具体操作步骤如下：

1）将细胞用无血清1640或L-15培养基培养12 h后，用0.125%胰蛋白酶消化、无血清1640或L-15培养基制备单细胞悬液，调整浓度为每毫升2.5×105个；

2）向24孔培养板中加入600 μL含10%小牛血清的1640或L-15培养基，然后将Transwell侵袭小室浸入，再向小室中加入200 μL无血清单细胞悬液（即5.0×104个细胞）；

3）37 ℃、5% CO2培养20 h后，取出Transwell小室，用棉签小心擦拭，将膜上表面的细胞去除；

4）用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下，把膜下表面向上放在一个洁净的24孔培养板的孔中；

5）将膜用甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定10 min，然后用10%结晶紫染液染色15～30 min；

6）将膜用蒸馏水漂洗干净后在倒置显微镜下（200×）随机选取6个视野（上、下、左、右各1个，中间2个）计数细胞。

2.7 软琼脂集落形成实验

1）取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度至每毫升1×106细胞。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

2）用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%这2个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40 ℃中不会凝固。

3）按1∶1比例使1.2%的琼脂糖和2×RPMI 1640 (含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合，然后取1.5 mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置CO2温箱中备用。

4）按1∶1比例使0.7%的琼脂糖和2×RPMI 1640培养基在无菌试管中混合，再向管中加入0.2 mL的细胞悬液，充分混匀，注入底层铺有1.2%琼脂糖的平板，使其形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃、5% CO2温箱中培养10 ～ 14 d。

5）将平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，并拍照。

2.8 数据统计

实验结果以x±s表示（n=3），采用t检验进行统计分析。*P＜0.05，认为具有统计学显著差异；**P＜0.01，认为具有统计学极显著差异。

3 结果

3.1 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b双酶切鉴定

重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b经HindⅢ和BamH I双酶切后，经2%的琼脂糖凝胶电泳观察，可见2个条带，其中110 bp处为pre-miR-125b基因，5073 bp处为载体片段（见图1），表明载体构建成功。

图1 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b的HindⅢ和BamHI双酶切鉴定结果Figure 1 Identification result of recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b by BamHI and HindⅢ digestion

3.2 PCR鉴定重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b

重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b经PCR扩增后，经2%的琼脂糖凝胶电泳观察，可见110 bp处的目的条带（见图2），表明载体构建成功。PCR扩增结果和酶切正确的质粒送上海生物工程技术有限公司测序。

图2 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b的PCR鉴定结果Figure 2 Identification result of recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b by PCR

3.3 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b的测序

进一步的测序分析结果证实，pSilencer 4.1多克隆位点（Bam HI和 Hind Ⅲ酶切位点之间）有110 bp的插入片段，其序列和方向与pre-miR-125b序列一致（见图3），表明miR-125b表达质粒构建成功。将重组质粒命名为pSilencer 4.1-miR-125b。

图3 重组质粒pSilencer 4.1-miR-125b的部分测序结果Figure 3 Partial sequencing results of recombinant plasmids pSilencer 4.1-miR-125b

3.4 MCF-7-miR-125b乳腺癌细胞中miR-125b表达水平的研究

最终确定MCF-7筛选剂量为600 mg·L-1。通过实时定量PCR检测稳定表达pSilencer 4.1-miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b中的miR-125b表达水平，结果显示，MCF-7-miR-125b中miR-125b表达量较MCF-7细胞提高了13.06倍，表明，稳定表达pSilencer 4.1-miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b构建成功（见图4）。

图4 乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7-miR-125b中miR-125b的表达水平Figure 4 Expression of miR-125b in brest cancer cells MCF-7 and MCF-7-miR-125b

3.5 miR-125b对细胞二维水平迁移能力的影响

通过划痕损伤模型分析稳定过表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7在二维水平上的迁移能力，结果显示：在划痕损伤36 h后，稳定过表达miR-125b的MCF-7细胞的迁移能力较miR-125b低表达的MCF-7细胞提高了2.3倍（见图5）。

图5 MCF-7-miR-125b和MCF-7二维水平迁移能力的比较Figure 5 Comparison of migration ability between MCF-7-miR-125b and MCF-7 on 2D level

3.6 miR-125b对细胞三维水平侵袭能力的影响

通过侵袭小室模型分析了稳定过表达miR-125b对MCF-7细胞三维水平迁移能力的影响。结果显示，MCF-7-miR-125b细胞从Transwell侵袭小室上室穿过8 μm孔径的PET膜迁移到下室的细胞数目显著增多（见图6），表明miR-125b能够显著增强细胞在三维水平上的侵袭能力。

图6 MCF-7-miR-125b和MCF-7三维水平迁移能力的比较Figure 6 Comparison of migration ability between MCF-7-miR-125b and MCF-7 on 3D level

3.7 miR-125b对MCF-7细胞集落形成能力的影响

通过软琼脂糖集落形成实验考察了稳定过表达miR-125b对MCF-7细胞集落形成能力的影响。结果显示，MCF-7-miR-125b细胞形成新生克隆数较MCF-7有显著的提高（见图7），表明上调miR-125b表达水平可以促进MCF-7细胞形成新生克隆的能力。

图7 miR-125b对MCF-7细胞集落形成的影响Figure 7 The effect of miR-125b on tumor cell clone formation

4 讨论

miRNA具有多种多样的生物学功能，与许多疾病的发生和发展有着密切关系，它主要是在转录后调控基因的表达。人们在研究miRNA的作用时，大多使用合成的miRNA进行转染，但RNA有不稳定、易降解、保存条件要求高、半衰期短等许多不足之处，转染RNA后也难以获得稳定的细胞株用于进一步的功能研究。利用原始miRNA（pre-miRNA）构建表达载体则能够克服上述缺点。此外，pre-miRNA保留了每个miRNA独自的原始天然双臂结构，使其在真核细胞中表达后不影响miRNA的功能，可以说，构建pre-miRNA或miRNA前体(pri-miRNA)表达载体，是目前miRNA过表达研究的主要方法。

先前有研究证实瞬时转染miR-125b-mimics能上调MCF-7细胞中miR-125b表达水平且可以促进MCF-7细胞的转移能力[12]。本实验构建了可稳定表达miR-125b的pSilencer 4.1载体并通过G418筛选获得了稳定表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b，然后通过二维划痕愈伤实验、三维Transwell侵袭小室实验、集落形成实验进一步证实了miR-125b具有促进乳腺癌转移的能力。笔者所在课题组主要研究miR-125b在转录后调控乳腺癌细胞转移的机制，曾考虑用合成的miR-125b-mimics瞬时转染细胞，但mimics的半衰期较短，不适合进行长期药理学实验研究；而质粒载体pSilencer 4.1-CMV neo具有强启动子CMV，这种启动子适合操纵miRNA的表达，且pSilencer 4.1-CMV neo具有新霉素抗性，便于转染后稳定表达miR-125b细胞的筛选，另外质粒载体还有稳定、易操作的优点，故本研究最终选用pSilencer 4.1-CMV neo构建了miR-125b真核表达载体。

本实验所构建的miR-125b真核表达载体可广泛应用于各种哺乳动物细胞并获得稳定高表达miR-125b的细胞模型，可用于长期研究和观察，不仅为研究miR-125b转录后水平调控乳腺癌细胞转移的机制提供了技术支撑，也为今后研究miR-125b的其他生物功能打下了良好的工作基础。

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Influence of Stable Over-expression of miR-125b on Metastasis of Breast Cancer Cell Line MCF-7

TANG Feng1,2, YANG Jue2, LI Runle1,3, GE Rili1, XI Tao2
(1. Research Center for High Altitude Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China; 2. Research Center of Biotechnology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 3. Department of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: To explore the effect of miR-125b on metastasis of breast cancer cell line MCF-7 by constructing eukaryotic expression vector stably expressing miR-125b. Methods: The recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b was constructed and used to transfect MCF-7 cells. MCF-7-miR-125b cells which could stably over-express miR-125b were obtained by G418 screening. The wound healing assay, transwell assay and clone forming assay were used to explore the effect of miR-125b on metastasis of breast cancer cells. Results: The MCF-7-miR-125b cells which could stably over-express miR-125b were successfully constructed. The migration capability in 2D and 3D level of MCF-7-miR-125b cells was significantly stronger than that of MCF-7 cells. The clone forming quantity of MCF-7-miR-125b cells was also larger than that of MCF-7 cells. Conclusion: The miR-125b can promote the metastasis of breast cancer cells.

miR-125b; eukaryotic expression vector; breast cancer; cell metastasis

R73-37

B

1001-5094 (2014) 01-0057-06

接受日期：2013-09-04

项目资助：青海省自然科学基金资助项目（No.2013-Z-938Q）；国家自然科学基金资助项目（No.81360300）

*通讯作者：格日力，教授；

研究方向：高原医学；

Tel：0971-6142063；E-mail：geriligao@hotmail.com**通讯作者：奚涛，教授；

研究方向：分子药理学；

Tel：025-83271022；E-mail：xi-tao18@hotmail.com