RGD肽修饰重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备和表征以及肿瘤细胞对其摄取作用

周欣,王伟*,王玉,冯美卿,丁杨,刘聪燕,周建平**

(1.中国药科大学药剂学教研室天然药物活性组分与药效国家重点实验室,江苏 南京210009;2.南京医科大学药理学系,江苏 南京210029; 3.复旦大学药学院智能化递药教育部重点实验室,上海201203)

RGD肽修饰重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备和表征以及肿瘤细胞对其摄取作用

周欣1,王伟1*,王玉2,冯美卿3,丁杨1,刘聪燕1,周建平1**

(1.中国药科大学药剂学教研室天然药物活性组分与药效国家重点实验室,江苏 南京210009;2.南京医科大学药理学系,江苏 南京210029; 3.复旦大学药学院智能化递药教育部重点实验室,上海201203)

目的:制备和表征RGD肽修饰的重组高密度脂蛋白(RGD-rHDL)载药纳米粒,考察肿瘤细胞对其摄取作用｡方法:合成RGD与载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)的偶联物(RGD-ApoAⅠ),并以藤黄酸(GA)作为模型药物,采用薄膜分散法制得GA脂质体(LP-GA),再将RGDApoAⅠ与LP-GA共孵育,制备载有GA的RGD-rHDL纳米粒(RGD-rHDL-GA);随后,对RGD-rHDL-GA进行表征,且采用荧光标记示踪法,通过RGD-rHDL-香豆素-6来考察人肝癌细胞HepG2对载药RGD-rHDL纳米粒的摄取作用｡结果:制备的RGD-rHDL-GA呈现规则圆整的类球形,粒径分布均一[(110.70±3.25)nm],Zeta电位为(-39.21±0.10)mV,包封率为(92.20±0.28)%,载药量为(9.03±0.75)%,且其体外释药缓慢,稳定性良好;RGD-rHDL-香豆素-6的肿瘤细胞摄取率明显高于rHDL-香豆素-6｡结论:rHDL经RGD修饰后可有效促进所载药物进入肿瘤细胞,提高其肿瘤靶向性｡

RGD肽;载脂蛋白AⅠ;重组高密度脂蛋白;藤黄酸;脂质纳米粒;体外细胞摄取

肿瘤已成为严重威胁人类生命与健康的多发病和常见病,化疗是目前临床治疗肿瘤的主要手段之一。然而,化疗药物由于缺乏靶向性,无法有效蓄积于肿瘤部位,在杀伤癌细胞的同时,也会杀伤大量的正常细胞,普遍存在临床疗效低、毒副作用大、顺应性差、对转移灶难以控制等问题。人们发现,由于肿瘤组织的特殊生理病理结构,纳米粒制剂可借助其高透过性及滞留效应(EPR效应)而选择性地在肿瘤部位蓄积,但这种被动靶向作用有限;而利用对肿瘤细胞上特异性或过表达受体的识别作用来增强药物载体的主动靶向效果,则可显著提高药物制剂的靶向性,从而改善药物疗效,降低其毒副作用。

高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)是一种广义的内源性脂质体,其独特的亲水-疏水结构、较大的脂质核心、较长的半衰期、良好的生物相容与生物可降解性以及不被网状内皮系统识别和清除的特性[1],使其用作药物载体的研究备受关注[2]。重组HDL(reconstituted HDL,rHDL)由内源性分离或体外合成的载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)与磷脂等在体外重组形成,是具有仿生学意义的药物载体,拥有天然HDL的多种优良特性[3]。ApoAⅠ作为rHDL的主要成分,可有效维持rHDL结构的稳定性与完整性[4-5],且可与一些肿瘤细胞表面高表达的HDL受体特异性结合,使用作药物载体的rHDL具肿瘤靶向性,而在ApoAⅠ的赖氨酸残基上进行功能化修饰以赋予rHDL新的肿瘤识别标志,可进一步提高其作为抗癌药物载体的靶向性[6]。

RGD肽(简称RGD)是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽,广泛存在于生物体内,是整合素(integrin)与其配体蛋白相互作用的识别位点。整合素αvβ3是整合素家族中重要一员,它在绝大多数正常器官系统和正常血管内皮细胞中不表达或少量表达,而在多种肿瘤细胞表面和肿瘤新生血管内皮细胞上过表达。外源性RGD作为整合素αvβ3的特异性配体,可将与其偶联的治疗效应分子靶向导入肿瘤部位,有效减少肿瘤治疗中对正常组织细胞的损伤[7]。

藤黄酸(gambogic acid,GA,1)是中药藤黄的主要活性成分之一,具有较强的抗肿瘤活性,且抗瘤谱广、毒性低[8-9]。但GA水溶性差,目前临床试验使用的GA注射剂主要通过L-精氨酸或聚氧乙烯蓖麻油来增溶,可是聚氧乙烯蓖麻油的加入会引起一系列不良反应,如过敏、肾毒性等[10];此外,GA静注后,体内消除半衰期较短(大鼠和犬体内分别为15和60min),且其大量经胆汁排泄[11]。这些缺点使得GA在肿瘤细胞中难以达到发挥治疗作用的有效浓度。因此,需要用一种安全有效的载体运载藤黄酸,以增加其溶解度,延长其在体内的滞留时间,提高其生物利用度,并提高其靶向性。

本文合成了RGD与ApoAⅠ的偶联物(RGD-ApoAⅠ),并以磷脂、胆固醇、藤黄酸(GA)为原料,采用薄膜分散法制得GA脂质体(LP-GA),再将RGD-ApoAⅠ 与LP-GA共孵育,制备载有GA的RGD修饰rHDL纳米粒(RGD-rHDL-GA);随后,对RGD-rHDL-GA进行表征,考察其粒径、聚合物分散指数、Zeta电位、形态、包封率、载药量及体外释放特性,且初步评价肿瘤细胞对RGD-rHDL-GA的体外摄取作用。

1 材料

1.1 仪器

RE52CS旋转蒸发器(天津玻璃仪器厂);透析袋[截留分子质量(MWCO)为3500,上海绿鸟科技发展有限公司];细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);Nano-ZS90激光粒度仪(英国Malvern公司);LC-2010C高效液相色谱仪(日本岛津公司);ECLIPSETi-S倒置荧光显微镜(日本Nikon公司);原子力显微镜(美国Veeco精密仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

GA(自制,纯度大于90%);GA对照品(纯度为95%,江苏康缘药业股份有限公司);大豆卵磷脂(注射级,上海太伟制药有限公司);胆固醇(分析纯,上海惠兴生化试剂有限公司);胆酸钠(北京索莱宝科技有限公司);ApoAⅠ(纯度大于90%,复旦大学药学院提供);RGD(纯度大于95%,上海强耀生物科技有限公司);预染蛋白Marker(生兴生物技术有限公司);香豆素-6(Sigma-Aldrich公司)。甲醇为色谱纯,氯仿和乙醇为分析纯。

1.3 细胞

人肝癌细胞HepG2,由中国药科大学药理学教研室提供。

2 方法和结果

2.1 RGD-ApoAⅠ的合成及表征

称取ApoAⅠ5mg,充分溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中,制得ApoAⅠ溶液。称取适量交联剂,溶于1.5mL双蒸水中,将其逐滴加入ApoAⅠ溶液中,反应1 h,取1.2倍当量的RGD加入反应液中,继续反应1h,反应毕,反应液用PBS透析24 h,即得RGD-ApoAⅠ,将其冻干备用。采用经典的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,分别在上样孔中加入ApoAⅠ和制得的RGD-ApoAⅠ,以蛋白Marker为参考,进行电泳分析;电泳完毕后,蛋白条带用考马斯亮蓝R250染色,结果见图1。

图1 ApoAⅠ和RGD-ApoAⅠ的SDS-PAGE图谱Figure 1 SDS-PAGE diagram of ApoAⅠ and RGDApoAⅠ

由图1可见,ApoAⅠ和RGD-ApoAⅠ表现出不同的迁移速率,RGD-ApoAⅠ的迁移速率明显低于ApoAⅠ;对照蛋白Marker,ApoAⅠ和RGD-ApoAⅠ的分子质量分别约为28000和35000～40000,证明RGD和ApoAⅠ化学偶联成功,合成了目标产物RGD-ApoAⅠ。

2.2 LP-GA、rHDL-GA和RGD-rHDL-GA的制备

采用薄膜分散法,取GA24mg、大豆卵磷脂480mg、胆固醇60mg和胆酸钠4mg,置茄形瓶中,加入氯仿使之完全溶解,30℃减压旋蒸除去有机溶剂,在瓶壁形成一层均匀薄膜,取出茄形瓶,继续用氮气吹10min,置于真空干燥箱中干燥过夜,除尽痕量有机溶剂,然后加入6mLTris-HCl缓 冲 液 (pH8.0,0.01mol·L-1,含 0.1mol·L-1KCl和1mmol·L-1EDTA),常压下通氮气旋转洗膜,水化液转移至细胞破碎仪中探头超声(150W)处理30min,即得半透明的LP-GA胶体溶液,过0.22μm微孔滤膜,收集滤液并分装,于4℃保存备用。

称取ApoAⅠ和RGD-ApoAⅠ冻干品各5mg,用去离子水复溶,分别在室温下与制备的LP-GA共孵育过夜(12 h),即得RGD-rHDL-GA和rHDL-GA的混悬液,将其通过预饱和的SephadexG-100柱(1cm×18cm,5μm)分离纯化,用PBS(pH7.4)洗脱,除去未包封的GA和未结合的蛋白,收集混悬液部分,冻干备用。

2.3 用于藤黄酸含量测定的HPLC法的建立

2.3.1 色谱条件 色谱柱 ：HederaODS-2柱(4.6mm×250mm, 5μm);流动相:甲醇-水(94:6),以磷酸调pH至3.5;流速:1.0mL· min-1;柱温:30℃;进样量:20μL;检测波长:360nm[12]。

2.3.2 线性考察 精密称取GA对照品,用流动相溶解并定容,配制成100mg·L-1的GA贮备液;精密移取贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL至10mL容量瓶中,流动相定容,制得质量浓度分别为10、20、30、40、50、60mg·L-1的GA标准溶液;按“2.3.1”项下条件,进行HPLC检测,记录色谱图,以GA峰面积( A )对质量浓度( C )作一元线性回归,得回归方程:A=20654.70C -1021.72(n=5,R2=0.9999)。表明,GA在10～60mg·L-1范围内线性良好,符合含量测定要求。

2.4 LP-GA、rHDL-GA和RGD-rHDL-GA的表征

2.4.1 粒径、聚合物分散指数及Zeta电位 取LP-GA、rHDL-GA和RGD-rHDL-GA的溶液各适量,用蒸馏水稀释,激光粒度仪测定其粒径、聚合物分散指数(PDI=体积平均粒径/数量平均粒径)和Zeta电位,结果见表1。由表1可见,LP-GA、rHDL-GA和RGD-rHDL-GA的Zeta电位均为负值,表面的高Zeta电位可提供足够的静电斥力,使体系趋于稳定;RGD-rHDL-GA和rHDL-GA的粒径均在110nm左右,没有明显差异,而与LP-GA相比,RGD-rHDL-GA的粒径明显增大约30nm,说明RGDApoAⅠ已成功嵌入LP-GA中,形成RGD-rHDL-GA。

表1 LP-GA、rHDL-GA和RGD-rHDL-GA的粒径、PDI和Zeta电位Table 1 Particle sizes,PDIs and Zeta potentials of LPGA,rHDL-GA and RGD-rHDL-GA

2.4.2 粒子形态 将LP-GA和RGD-rHDL-GA混悬液分别滴加到天然矿物云母片的平滑表面,干燥后通过原子力显微镜观察其粒子外观形态,结果见图2。

图2 LP-GA（A）和RGD-rHDL-GA（B）的原子力显微镜图片Figure 2 AFM images of LP-GA(A) and RGD-rHDLGA(B)

由图2可见,LP-GA和RGD-rHDL-GA的粒子均呈类球形颗粒状,尤其RGD-rHDL-GA粒子形态均一圆整,且2种粒子的粒径分布均一,分别在80和120nm左右,这与激光粒度仪测定的粒径结果基本一致;RGD-rHDL-GA粒径明显大于LP-GA,进一步说明RGD-ApoAⅠ已嵌入LP-GA中,RGD-rHDL-GA构建成功。

2.4.3 包封率与载药量 采用离心超滤法测定RGD-rHDLGA的包封率(entrapment efficiency,EE)与载药量(drug loading efficiency,DLE)。精密量取RGD-rHDL-GA溶液500μL,置于Nanosep超滤离心管上层,10000r·min-1离心5min,取下清液200μL,用甲醇稀释至1mL,按“2.3.1”项下色谱条件,进样,测定GA含量(即RGD-rHDL-GA中包封的药量We),并按公式(1)和(2)计算RGD-rHDL-GA的EE和DLE,其中,Wt和Wc分别为RGD-rHDL-GA中总投药量和载体总量。结果,测得RGD-rHDL-GA的EE 为(92.20 ±0.28)%,DLE 为(9.03 ±0.75)%。

2.4.4 体外释放特性 为了模拟体内血液系统中性环境和肿瘤组织酸性环境,采用动态透析法分别考察RGD-rHDLGA和rHDL-GA在pH7.4和pH5.5释放介质中的体外释放动力学。精密称取一定量的RGD-rHDL-GA和rHDL-GA冻干粉(约相当于20mgGA),以少量去离子水复溶后,置于透析袋(MWCO=3500)内,分别以200mLpH7.4和pH5.5的PBS(含0.001g·mL-1Tween-80)为释放介质,转速为100r·min-1,介质温度为(37±0.5)℃,在不同时间点每次取样1mL,并同时补充相同体积的空白介质至透析袋外释放液中;按“2.3.1”项下色谱条件,测定各时间点释放液中GA含量,计算其累计释放百分率,结果见图3。

图3 RGD-rHDL-GA和rHDL-GA在不同pH介质中的体外释放动力学（x±s, n =3）Figure 3 In vitro release kinetics of RGD-rHDL-GA and rHDL-GA in the media of different pH

由图3可见,在pH 7.4释放介质中,RGD-rHDL-GA和rHDL-GA的释药速度缓慢,24h后,仍有约95%GA未能释放,且无突释现象,这可能是由于二者表面包覆了两亲性的ApoAⅠ,从而提高了其释药稳定性,为实现其体内肿瘤细胞靶向定位释药奠定基础;在pH5.5释放介质中,72h内,二者的累积释放百分率约达70%,究其原因,可能是二者中的ApoAⅠ在较低pH环境下构象发生变化,破坏了载体的完整性,从而促进了药物在肿瘤组织的释放;2种载药纳米粒在不同pH介质中的释放行为均无显著性差异,表明RGD的修饰并不影响载体对GA的释放。

2.5 细胞摄取实验

以脂溶性染料香豆素-6作为荧光探针,按“2.2”项下方法制备rHDL-香豆素-6和RGD-rHDL-香豆素-6纳米粒。采用荧光显微术定性观察和流式细胞术定量考察HepG2细胞对纳米粒的摄取。取对数生长期状态良好的HepG2细胞,以每孔105个细胞接种于24孔培养板中,每孔500μL,37℃培养24h后,吸去培养液,分别加入用不含血清的RPMI1640培养基(pH7.4)稀释的rHDL-香豆素-6和RGD-rHDL-香豆素-6溶液(磷脂质量浓度为62.5mg·L-1)500μL,37℃ CO2培养箱中孵育2h;另设竞争性抑制对照组,将10倍当量的游离RGD(作为受体阻断剂)溶于不含血清的RPMI1640培养基中,加入同样的培养板中与HepG2细胞孵育1h后,再加入RGD-rHDL-香豆素-6,于相同培养箱中共孵育2h。而后,移去各组培养板中上层供试液,用冷PBS(pH7.4)洗涤3遍,于倒置荧光显微镜下观察;同时,在经冷PBS洗涤后的各组培养板中,加入胰酶消化,吸弃胰酶,再加入完全培养基终止消化,吹落细胞,用PBS洗涤3次后,以流式细胞术考察各组细胞的荧光强度。结果见图4、5。

图4 rHDL-香豆素-6组（A）、RGD-rHDL-香豆素-6组（B）和对照组（C）中HepG2细胞的荧光显微图片Figure 4 Fluorescence microscopic images of HepG2 cells incubated with rHDL-coumarin-6(A),RGD-rHDL-coumarin-6(B) and free RGD+RGD-rHDL-coumarin-6(C) respectively

图5 各组HepG2 细胞的荧光强度（x±s, n =3）Figure 5 Fluorescence intensities of HepG2 cells in each group

由图4可见,在各组中,RGD-rHDL-香豆素-6组细胞的荧光亮度明显强于其他2组。图5也显示,RGD-rHDL-香豆素-6组细胞的荧光强度约为其他2组的5.3倍和5.5倍,表明,RGD-rHDL-香豆素-6被细胞摄入的量显著多于rHDL-香豆素-6和经受体阻断剂作用后RGD-rHDL-香豆素-6的摄入量,而后二者的细胞摄入量相当,且rHDL经RGD修饰后可有效促进所载药物进入肿瘤细胞。

3 讨论

ApoAⅠ等电点为5.5,在pH7.4的缓冲溶液中带负电荷。Zeta电位检测结果显示,RGD-rHDL-GA所带负电荷低于LP-GA,原因可能在于ApoAⅠ的插入,使得LP-GA中部分负电荷被ApoAⅠ的局部正电荷所掩盖,使得RGD-rHDL-GA所带负电荷降低;而与rHDL-GA相比,RGD-rHDL-GA的负电荷增加,原因可能在于在缓冲体系中RGD肽带负电荷,RGD肽属亲水性短肽,暴露于磷脂双层的外侧,所以RGD-rHDL-GA 所带负电荷高于rHDL-GA。且ApoAⅠ属两亲性物质,同时含有亲水和疏水片段。在室温下,将RGD-ApoAⅠ与LP-GA混合孵育,ApoAⅠ的疏水片段会嵌入LP-GA的磷脂双层中,而与ApoAⅠ偶联的RGD属亲水性短肽,则暴露于磷脂双层的外侧,这为实现RGD-rHDL-GA的肿瘤细胞定位释药创造了有利条件。

在制备RGD-rHDL-GA的过程中,本文采用了共孵育的方式,将RGD-ApoAⅠ嵌入LP-GA,并在共孵育一定时间后,应用考马斯亮蓝法(Bradford法),以RGD-ApoAⅠ结合率为参考标准,来判断RGD-ApoAⅠ与LP-GA是否孵育完全。其间,发现共孵育时间对RGD-ApoAⅠ结合率有较大影响,因此笔者考察了RGD-ApoAⅠ和LP-GA共孵育时间分别为0.5、1、4、8、12、16 h时的结合率,结果表明,4 h时RGD-ApoAⅠ结合率仅为35%,8 h时结合率有所增加,直至12 h时结合率基本达到平衡。故最终选择共孵育时间为12 h。

纳米粒体外肿瘤细胞摄取是评价纳米粒肿瘤靶向性的手段之一,本文通过荧光标记示踪法考察了HepG2细胞对纳米粒的摄取。香豆素-6是一种脂溶性很强的高效荧光物质,与GA的脂溶性相似,采用荧光物质包载的方法将香豆素-6引入载体,不会影响载体材料表面性质,能够真实反映细胞对纳米粒的摄取情况,所以本文选择RGD-rHDL-香豆素-6来考察载药RGD-rHDL纳米粒进入细胞的能力。细胞摄取实验结果显示,RGD-rHDL-香豆素-6组细胞的荧光强度最强,推测原因可能是,RGD-rHDL-香豆素-6以完整纳米粒形式被细胞摄取,且其表面的小分子靶向肽RGD能特异性识别HepG2细胞表面高表达的整合素αvβ3,从而促进了细胞的内吞作用;而RGD-rHDL-香豆素-6组细胞的荧光强度明显高于对照组细胞,则表明作为受体阻断剂的游离RGD的加入能显著减少HepG2细胞对RGD-rHDL-香豆素-6的摄取,这进一步证实RGD-rHDL主要通过细胞表面高表达的αvβ3受体介导而进入细胞。因此,肿瘤细胞HepG2过表达整合素αvβ3,使得其与RGD-rHDL的亲和性增强,促进了细胞对RGD-rHDL所载药物的摄入,从而提高药物疗效。

虽然本文对所构建的RGD-rHDL-GA的表征和细胞摄取效果进行了评价,并获得较为满意的结果,但其体内靶向性和疗效尚需进一步论证,如通过活体成像实验考察其在荷瘤裸鼠中的体内肿瘤靶向性等,目前笔者所在课题组正在进行相关试验。此外,大多数内源性线性RGD在血浆中的半衰期极短,对整合素αvβ3受体的亲和力较低,其生物活性不够理想,因此,在后续的研究中应更多地关注对RGD的修饰与改造,以增强其稳定性、亲和性和特异性,提高其修饰的载药纳米粒在体内的肿瘤靶向性。

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Preparation and Characterization of Drug-Loaded, RGD Peptide- Modified and Reconstituted High Density Lipoprotein Nanoparticles and Their Uptake by Tumor Cells

Zhou Xin1, WANG Wei1,WANG Yu2,FENG Meiqing3,DING Yang1,LIU Congyan1,ZHOU Jianping1
(1.State Key Laboratory of Natural Medicines, Department of Pharmaceutics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Pharmacology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 3. Key Laboratory of Smart Drug Delivery Affiliated to Ministry of Education, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

Objective:To prepare and characterize the drug-loaded,RGD peptide-modified and reconstituted high density lipoprotein(RGD-rHDL) nanoparticles and to investigate their uptake by tumor cells. Methods:The RGD peptide-modified apolipoprotein AⅠ (RGD-ApoAⅠ) was synthesized. The gambogic acid-loaded liposome (LP-GA) was prepared by film dispersion method. Then GA-loaded RGD-rHDL nanoparticles (RGD-rHDL-GA) were generated by co-incubation of RGD-ApoAⅠ with LP-GA. The RGD-rHDL-GA particles were characterized and the uptake of the coumarin-6-loaded RGD-rHDL nanoparticles (RGD-rHDL-coumarin-6) by HepG2 cells was observed by using fluorescence labeling tracer method.Results: The prepared RGD-rHDL-GA possessed a spherical shape with uniform particle size distribution of (110.70±3.25)nm, Zeta potential of (-39.21±0.10)mV, entrapment efficiency of (92.20±0.28)% and drug-loading efficiency of (9.03±0.75)%, and showed a sustainedrelease pattern and good stability. The uptake of RGD-rHDL-coumarin-6 by HepG2 cells remarkably increased in comparison with that of rHDL-coumarin-6.Conclusion: RGD-rHDL could highly facilitate the specific receptor mediated intracellular uptake and improve its tumor targeting.

RGD peptide; apolipoprotein AⅠ; reconstituted high density lipoprotein; gambogic acid; lipid nanoparticle; cell uptake in vitro

R943

B

1001-5094（2014）01-0051-06

接受日期：2013-09-13

项目资助：国家自然科学基金资助项目(No.81102398)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20110096120003)；中央高校基本科研业务费专项基金资助项目(No.JKP2011007)；复旦大学药学院智能化递药教育部重点实验室开放课题资助项目(No.SDD2012-03)*

王伟,副教授；

研究方向：靶向性纳米药物传递系统；

Tel：025-83271102；E-mail：wangcpu@yahoo.com.cn

**通讯作者:周建平，教授；

研究方向：靶向性纳米药物传递系统；

Tel：025-83271102；E-mail：zhoujianp60@163.com