广东虫草深层发酵及菌丝体成分分析

林群英，李挺，宋斌，李泰辉

（广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州510070）

广东虫草深层发酵及菌丝体成分分析

林群英，李挺，宋斌，李泰辉*

（广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州510070）

对广东虫草（Cordyceps guangdongensis）深层发酵时菌丝体生长规律和发酵所获得的菌丝体成分进行初步的研究与分析。结果显示，广东虫草菌丝体在培养了50 h产量达最大值。溶氧量的下降速度在第30小时开始加快。广东虫草菌丝体的虫草酸含量较高，为46.3mg/g，腺苷为0.25mg/g，胞内粗多糖的含量为3.84%，水解氨基酸总量为26.6%，重金属含量符合食用菌安全标准。

广东虫草；深层发酵；成分分析

虫草是一类十分值得开发的大型真菌资源，不少种类具有良好的抗肿瘤、抗病原、抗氧化以及增强人体免疫功能等多种保健和药用功效[1]。目前，以冬虫夏草为代表的虫草产品价格高，需求量大，为满足强大的市场需求，有必要加强开发虫草的新资源。广东虫草（Cordyceps guangdongensis）是作者采集并驯化成功的种类，已实现其子实体的人工栽培[2-3]。液体深层发酵是食用菌重要的生产方式，具有快速获得大量产物的优点。本文利用发酵罐对广东虫草进行深层液体培养研究，并对所得菌丝体进行成分分析，为规模化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

斜面菌种：分离自人工培养的子实体，经纯化得母种，转管继代培养，25℃下暗培养10 d，再进行光照（10 h/d，400 Lx～500 Lx）培养10 d。培养基为PDA。

液体菌种：将斜面菌种接种至种子液体培养基YMPD（葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏3 g、麦芽浸出物3 g/L，pH 6.5）内，25℃下，150 r/min，振荡培养6 d。

发酵培养基：麦芽浸出物20 g/L，葡萄糖10 g/L，黄豆粉10 g/L，酵母浸膏4 g/L，pH6.5。

40 L的发酵罐内装入25 L发酵培养基，121℃，灭菌30min，冷却至室温后，发酵培养基体积为22.5 L，备用。

1.2 接种与培养

将液体菌种按10%的接种量接入发酵罐内，接种后终体积为25L。调节发酵罐各参数，通气量为8L/min～10 L/min，搅拌速度为180 r/min，温度（25±1）℃。培养过程中记录溶氧量和pH等参数的变化，自发酵24 h起每隔5小时采一次样。发酵至70 h后，终止发酵培养。1 000 r/min离心10min收集菌丝体，菌丝体在60℃下烘12 h至恒重，称重。

1.3 成分测定

粗蛋白含量按照GB/T5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》第一法测定，换算系数为6.25[4]；总灰分含量按照GB/T5009.4-2010《食品中灰分的测定》进行测定[5]；水解氨基酸含量按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》进行样品测定[6]；微量元素按照GB/ T5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》处理样品[7]，用IPC-MS法测定[8]；虫草酸、虫草素和腺苷含量按林群英等[9]所述方法进行测定；粗多糖含量按照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》进行测定[10]。

1.4 主要仪器设备

CH-8620WETZIKON发酵罐：Romabau AG；SXL-1008程控箱式电炉：上海精宏；日立L-8900氨基酸自动分析仪：日本日立公司；岛津LC220A高效液相色谱分析仪：岛津医疗器械有限公司；DUR640核酸蛋白分析仪：Beckman公司。

2 结果与分析

2.1 深层发酵

广东虫草深层发酵生长曲线见图1。

图1 广东虫草深层发酵的生长曲线Fig.1 Myceilal growth curve of Cordyceps guangdongensis under submerged culture

广东虫草在生长了50 h后达菌丝体干重达最大值10.33 g/L。发酵过程中，溶氧量和pH的变化情况见图2。

图2 广东虫草深层发酵溶氧量和pH变化Fig.2 Changes of concentration of dissolved oxygen and pH values in submerged culture of Cordyceps guangdongensis

随着菌丝生长的加快，发酵罐内培养基中的溶氧量一直呈下降的趋势，至第30小时，下降的速度明显加快，直到发酵培养结束仍未出现回升，说明菌丝的生长一直处于耗氧状态。发酵初期，培养基内的pH由开始的6.50升高至7.12，直到第41小时开始回落。由生长曲线可知，从第24至41小时是菌丝生长速率增长最大的阶段，随之进行较平稳的生长状态，至50 h达到平台期，生长速率开始出现下降情况（图2）。

2.2 成分分析

2.2.1 常规成分

广东虫草菌丝体粗蛋白和总灰分的含量分别为40.6%和8.4%，均比子实体的含量（27.5%和3.5%）高[9]。

2.2.2 水解氨基酸

广东虫草深层发酵菌丝体水解氨基酸含量见表1。

表1 广东虫草深层发酵菌丝体水解氨基酸含量Table1 Hydrolytic amino acid contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

广东虫草菌丝体含有16种氨基酸总和为26.6%，其中7种必需氨基酸总量为9.97%。

2.2.3 维生素

广东虫草菌丝体中VB1、VB2和VE的含量分别为0.29、2.03μg/g和434mg/100 g。而VC、VA和VD的含量低于检测下限。

2.2.4 微量元素

广东虫草菌丝体微量元素含量的测定结果见表2。

广东虫草菌丝体中锰、铁、铜、锌、镍、硒、钼和硅8种元素的含量分别为50.5、61.3、11.4、173、3.12、0.35、0.64mg/kg和84mg/kg，其余4种（铬、钴、钒和锡）含量低于检测限量0.5mg/kg。

表2 广东虫草菌丝体微量元素含量Table2 Microelement contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

2.2.5 有效成分

广东虫草菌丝体中虫草酸和腺苷的含量为46.3mg/g和0.25mg/g，而虫草素的含量则低于检测下限。广东虫草菌丝体的胞内粗多糖的含量为3.84%。

2.2.6 重金属

广东虫草菌丝体重金属含量测定结果见表3。

表3 广东虫草菌丝体重金属含量Table3 Heavy metal contents of Cordyceps guangdongensis mycelium

广东虫草菌丝体的重金属含量均在要求限量以下，符合食用菌质量要求。重金属是食用菌质量检测的重要指标[11]，分析结果显示，深层发酵所得的广东虫草菌丝体是安全的。

3 讨论

广东虫草在培养50 h后菌丝产量达到最大值，为10.33 g/L（约1.0%），稍低于蛹虫草（C.militaris，1.4%）和古尼虫草（C.gunnii，1.2%）[12-13]。但各种虫草有不同的生物学特性，产量稍低并不会对其开发利用前景产生决定性的影响，而且通过更进一步的研究，广东虫草菌丝体产量将得到提高，以满足实际生产的要求。通过一系列的成分分析证实，广东虫草菌丝体的营养成分和有效成分含量与冬虫夏草等虫草相近，甚至部分成分比目前已经开发的种类更高[14-15]。广东虫草菌丝体的粗蛋白比古尼虫草略高（37.3%），虫草酸的含量远比古尼虫草（0.57%）高[16]，有很好的开发前景。深层发酵是开发利用真菌的重要途径，本文通过小规模的发酵罐液体发酵获得广东虫草菌丝生长的基本数据并分析菌丝体的主要成分，为进一步规模化生产提供重要的参考。

[1]Das SK,Masuda M,Sakurai A,et al.Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris:Current state and prospects[J].Fitoterapia,2010,81(8):961-968

[2]林群英,李泰辉,宋斌,等.广东虫草人工栽培的光温条件研究[J].华南农业大学学报,2009(1):42-45

[3]Lin QY,Song B,Huang H,et al.Optimization of selected cultivation parameters for Cordyceps guangdongensis[J].Lett Appl Microbiol, 2010,51(2):219-225

[4]卫生部食品卫生监督检验所,河北省唐山市卫生防疫站.GB/ T5009.6-2010食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社, 2010

[5]卫生部食品卫生监督检验所.GB/T5009.4-2010食品中灰分的测定[S].北京:中国标准出版社,2010

[6]中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所.GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2003

[7]四川省食品卫生监督检验所,卫生部食品卫生监督检验所.GB/ T 5009.11-2003食品中总砷及无机砷的测定[S].北京:中国标准出版社,2003

[8]连晓文,杨秀环,梁旭霞.电感耦合等离子体质谱法测定葡萄酒中微量元素[J].理化检验:化学分册,2008,44(11):1108-1111

[9]林群英,李泰辉,宋斌,等.广东虫草与冬虫夏草及蛹虫草的成分比较[J].食用菌学报,2009,16(4):54-57

[10]农业部食用菌产品质量监督检验测试中心(上海),上海市农业科学院食用菌研究所.NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定[S].北京:中国农业出版社,2008

[11]天津市卫生局公共卫生监督所,辽宁省卫生监督所,四川省食品卫生监督检验所,等.GB7096－2003食用菌卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2003

[12]傅岚,黄红英,陈作红.古尼虫草液体深层发酵条件的研究[J].湖南师范大学:自然科学学报,2004,27(2):71-74

[13]李维光,苏凤岩,黄荣年.北冬虫夏草菌丝体吨级液体深层发酵及生理活性物质的研究[J].微生物学杂志,1997,17(1):32,37

[14]钟韩,甘莉霞,章卫民,等.戴氏虫草活性成分分析及其对小鼠免疫功能的影响[J].食用菌学报,2008,15(3):55-58

[15]马冰如,何玲,张甲生,等.蚕蛹虫草与冬虫夏草化学成分的比较[J].中国食用菌,1994,13(1):34-37

[16]叶昌秀.古尼虫草深层发酵工艺[J].贵州化工,2004,29(5):40-42

Studies on Submerged Culture and Chemical Components of Cordyceps guangdongensis Mycelial

LIN Qun-ying，LI Ting，SONG Bin，LI Tai-hui*
（Guangdong Institute of Microbiology，State Key Laboratory of Applied Microbiology in South China（Ministry-Province Co-Construction），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Technology，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

Preliminary studies on submerged culture and mycelial chemical components of Cordyceps guangdongensis were performed.Mycelial biomass of Cordyceps guangdongensis reached to highest after incubating for 50 h.The mycelium contained cordycepic acid at 46.3 mg/g，adenosine 0.25mg/g，polysaccharides 3.84% and total amino acids26.6%.The contents of heavy metals were under the levels in standard for edible mushrooms.

Cordyceps guangdongensis；submerged culture；component analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.023

2012-10-23

广东省自然基金项目（No.10451007002006249）；广东省科技计划项目（No.2010B020304005）；广州市科技计划项目（2007Z3-E0511）

林群英（1979—），女（汉），助理研究员，博士，研究方向：食用菌研究与开发。

*