黑米发酵乳的体外抗氧化活性研究

郭飞翔，韩青青，黄玉军，顾瑞霞，陈霞，鲁茂林

（江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127）

黑米发酵乳的体外抗氧化活性研究

郭飞翔，韩青青，黄玉军，顾瑞霞*，陈霞，鲁茂林

（江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127）

对黑米发酵乳抗氧化活性进行了研究。结果表明，当黑米发酵乳、普通发酵乳及20%黑米酶解液3种样品稀释8倍时，黑米发酵乳清除DPPH·，清除·OH，总抗氧化能力，螯合Fe2+能力都是最强的，分别为60.16%，30.76%，0.847，28.43%，并且都显著高于普通发酵乳和20%黑米酶解液的抗氧化能力。研究表明，黑米中的抗氧化功能成分与乳酸菌相互促进，发挥了协同作用，提高了黑米发酵乳的功能特性。

黑米；发酵乳；抗氧化；体外

黑米是一种药、食兼用的米，种植历史悠久，是我国古老而名贵的糯米类稻米，俗称“补血米”、“贡米[1]”。黑米中丰富的胡萝卜素、叶绿素、花青素具有良好的生理功能特性，如防治缺铁性贫血[2]，降血脂，预防动脉粥样硬化[3-5]，抗疲劳[6]，抗氧化[7-8]等。黑米发酵乳是将黑米经过酶解，与牛乳混合后进行发酵，牛乳蛋白质作为全价优质蛋白，对谷物中必需氨基酸有互补作用，同时保留黑米的营养成分，不仅使发酵乳口感更好，还可以补充牛乳碳水化合物，为人体提供丰富的膳食纤维、维生素及多种微量元素，并将黑米的功能特性在发酵乳中得到体现，开发黑米食品的新品种。尽管有研究人员从事黑米发酵乳的研究[9-11]，但大都只研究了黑米发酵乳的制作工艺，还没有人对黑米发酵乳的抗氧化功能进行研究。本研究通过对黑米发酵乳体外抗氧化活性的评价，以期为黑米发酵乳产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黑米购自扬州农贸市场；α-淀粉酶（20 000U/mL）购自湖州礼来生物技术有限公司；糖化酶（100 000U/g）购自张家港市金源生化有限公司；酸奶发酵菌种为扬州大学乳品研究所分离保藏；脱脂乳粉，全脂乳粉购自新西兰威士兰乳业公司；DPPH自由基购自Sigma公司；无水乙醇、三氯乙酸、铁氰化钾、抗坏血酸、氯化钠、氯化亚铁、硫酸亚铁、水杨酸和EDTA购自国药集团化学试剂有限公司；菲洛嗪购自上海生工生物有限公司。

1.2 设备

BOS-60搅拌机：上海标本模型厂；HH-6型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；BS210S型电子天平（1/10000）：北京赛多利斯天平有限公司；SW-CJ-1F型单人双面工作净化台：苏州净化设备有限公司；755s型紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司；SHZ-Ⅲ B型循环水真空泵：上海仪（集团）供销公司；5804R型冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 样品的制备

1.3.1 黑米酶解液的制备

黑米清洗两遍，然后在55℃下浸泡2 h后趁热磨浆，过20目筛，加水调整料水比为1∶4，在80℃的水浴锅中糊化30min，用饱和Na2CO3溶液调节糊化液pH，加入高温α-淀粉酶95℃下液化，以碘液检验至所需DE值后煮沸5min～10min，快速冷却，用10%柠檬酸溶液调节pH，再加入糖化酶进行糖化，用无水乙醇检验至无白色沉淀后，经85℃热处理10min灭去酶的活力，过100目筛制得黑米酶解液，最后用饱和Na2CO3调节其pH为6.4～6.8，备用。

1.3.2 普通发酵乳的制备

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%）95℃杀菌5min，冷却至42℃，并按体积分数3%接入菌种，于42℃培养至pH为4.5左右，迅速置于冰水中冷却至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.3.3 黑米发酵乳的制备

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%，黑米酶解液20%），95℃杀菌5min，冷却至42℃，并按体积分数3%接入菌种，于42℃培养至pH为4.5左右，迅速置于冰水中冷却至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.4 样品的处理

称取冷藏24 h后的黑米发酵乳和普通发酵乳各100 g，采用减压抽滤的方式进行过滤，并收集滤液，将滤液分别稀释至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍；将黑米酶解液与双蒸水按1∶4的比例配成20%的黑米酶解液，同时也稀释至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍。

1.5 黑米发酵乳抗氧化活性的测定

1.5.1 黑米发酵乳对DPPH·的清除能力

参照文献[12]所述方法并略做改动，取样品2.0mL与2.0mL95%乙醇混匀，再加入浓度0.2mmol/LDPPH溶液2.0mL于具塞试管中，摇匀，避光放置30min后，3 000 r/min条件下离心10min，用95%乙醇作参比测定其吸光度Ai。同时测定0.2mmol/LDPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待测液与等体积95%乙醇混合液在517 nm处的吸光度Aj。本研究以VC为对照。DPPH·清除率用下式表示：

1.5.2 黑米发酵乳对·OH的清除能力

参照文献[13]所述方法，将2mL的6mmol/L硫酸亚铁水溶液与2mL的6mmol/L水杨酸-乙醇溶液混合后，将样品加入后，再加入2mL的20mmol/L的过氧化氢溶液，混匀后在37℃的恒温水浴中反应1 h时，3 000 r/min条件下离心10min，取出冷却后在510 nm处测定吸光值A2。同时测定不加样品只加H2O2时的吸光值A1，以及用双蒸水做空白对照时的吸光度A0。本研究以VC为对照。·OH清除率用下式表示：

1.5.3 黑米发酵乳总抗氧化能力

参照文献[14]所述方法并略做改动，将样品1.0mL与2.0mL pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH6.6）混合，再加入1%的铁氰化钾2.0mL。混合物于50℃水浴20min后，加入1.0mL10%的三氯乙酸，4 000 r/min 10min，取上清液2.5mL，加双蒸水2.5mL和0.1%的FeCl30.5mL反应10min后，700 nm处测吸光度。吸光度越高，说明反应混合物的还原性越强，样品的总抗氧化能力越强。

1.5.4 黑米发酵乳对Fe2+螯合能力

参照文献[15]所述方法并略做改动，取2mL样品，加入2mL 0.01mmol/LFeCl2·4H2O溶液和2mL 0.25mmol/L菲洛嗪，振荡混匀。反应混合物静置10min，在562 nm下测定吸光度As，用双蒸水做空白对照测定吸光度Ac。本研究以EDTA为对照。Fe2+鳌合能力用下式表示：

1.5.5 数据处理

用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑米发酵乳对DPPH·的清除能力

将制备的不同稀释倍数的黑米发酵乳、普通发酵乳的滤液及20%黑米酶解液及VC（0.006mg/mL）对DPPH·清除能力进行测定，其结果如图1。

图1 不同样品对DPPH·的清除活性Fig.1 Scavenging effect of different samples against the DPPH· radical

由图1可以看出，3种样品对DPPH·的清除能力与样品的稀释倍数成线性关系。未经稀释时，黑米发酵乳对DPPH·的清除率达到94.51%，而黑米酶解液和普通发酵乳的清除率分别为90.96%和88.01%，随着稀释倍数的增加，即样品浓度的减小，样品对DPPH·的清除能力减弱。当稀释到8倍时，黑米发酵乳清除率为60.16%，与浓度为0.006mg/mL的VC清除能力相当（p＞0.05），并且黑米发酵乳与其他两种样品清除DPPH·的能力均存在着显著性差异（p＜0.05）。

2.2 黑米发酵乳对·OH的清除能力

将制备的不同稀释倍数的黑米发酵乳、普通发酵乳滤液及20%黑米酶解液样品及VC（6mg/mL）对·OH的清除能力进行测定，同样三种样品对·OH的清除能力与样品的稀释倍数成线性关系。样品稀释8倍时，其清除·OH结果如图2。

图2 不同样品对·OH的清除活性Fig.2 Scavenging effect of different samples against the hydroxyl radical

由图2可以看出，三种样品存在不同的·OH清除能力。当样品稀释8倍时，黑米发酵乳对·OH清除率30.76%，与浓度为6mg/mL的VC清除能力相当（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液21.03%，普通发酵乳18.49%，并且黑米发酵乳与其他两种样品清除·OH能力存在显著性差异（p＜0.05）。

2.3 黑米发酵乳对总抗氧化能力

将制备的不同稀释倍数的黑米发酵乳、普通发酵乳滤液及20%黑米酶解液样品及VC（0.15mg/mL）的总抗氧化能力进行测定，同样三种样品的总抗氧化能力与样品的稀释倍数成线性关系。样品稀释8倍时，其总抗氧化能力结果如图3。

图3 不同样品的总抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of different samples

由图3可以看出，三种样品存在一定的总抗氧化能力。当样品稀释8倍时，黑米发酵乳的总抗氧化能力最强，为0.847，与浓度为0.15mg/mL的VC清除能力相当（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液0.642，普通发酵乳0.466，并且黑米发酵乳与其他两种样品总抗氧化能力存在显著性差异（p＜0.05）。

2.4 黑米发酵乳对Fe2+螯合能力

将制备的不同稀释倍数的黑米发酵乳、普通发酵乳滤液及20%黑米酶解液样品及EDTA（0.02mg/mL）对亚铁离子螯合能力进行测定，同样三种样品对Fe2+螯合能力与样品的稀释倍数成线性关系。样品稀释8倍时，其螯合能力结果如图4。

图4 不同样品的亚铁离子螯合能力Fig.4 Ferrous ion chelating capacities of different samples

如图4可以看出，三种样品存在一定的Fe2+螯合能力。当样品稀释8倍时，黑米发酵乳的螯合能力最强，为28.43%，与浓度为0.02mg/mL的EDTA的螯合能力相当（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液9.62%，而普通发酵乳的螯合率只有4.51%，黑米发酵乳螯合Fe2+能力接近为它的7倍。

3 讨论

对黑米发酵乳、普通发酵乳及20%黑米酶解液三种样品的体外抗氧化活性进行了研究发现，黑米发酵乳体外抗氧化能力是三种样品中最强的。其中黑米发酵乳的抗氧化能力比20%黑米酶解液强，说明乳酸菌的发酵能提高黑米酶解液的抗氧化活性；黑米发酵乳的抗氧化能力比普通发酵乳强，尤其是体现在两者螯合亚铁离子的能力上，黑米发酵乳是普通发酵乳的7倍，说明黑米中功能性成分发挥了作用。

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In Vitro Study on the Antioxidant Activities of Fermented Black Rice Milk

GUO Fei-xiang，HAN Qing-qing，HUANG Yu-jun，GU Rui-xia*，CHEN Xia，LU Mao-lin
（Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

Based on the in vitro experiments，the antioxidant activities of fermented black rice milk was studied. The results showed that when fermented black rice milk，ordinary fermented milk and 20% of black rice juice were diluted 8 times，the fermented black rice milk had the most antioxidant activities in three samples.The fermented black rice milk scavenging DPPH，hydroxyl radicals，reducing power and chelating ferrous ion were 60.16%，30.76%，0.847，28.43%and obviously higher than the other samples.It showed that the antioxidant functional composition of black rice and lactic acid bacteria played a synergy and improved the functional characteristics of the fermented black rice milk when they were mixed.

black rice；fermented milk；antioxidant；in vitro

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.002

2012-12-15

江苏高校优势学科建设工程资助项目；国家科技支撑计划项目（2013BAD18B12）；江苏省科技支撑项目（BE2011383）；江苏省高校自然科学研究重大项目(12KJA550003);教育部博士点基金（20093250110005）；青年科学基金项目（31201393）

郭飞翔（1990—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：乳品科学。

*通信作者：顾瑞霞（1963—），男（汉），教授，博士生导师，研究方向：乳品科学。