p53、PUMA、MCL-1对于凋亡途径的调控

师迎旭(综述)，苏秀兰(审校)

(内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，呼和浩特 010050)

自1979年以来，p53被证实主要在维护基因组的稳定性和调节细胞凋亡中发挥重要作用。目前，p53在其他方面的作用也逐步被发现[1]。激活的p53可以抑制细胞转化、诱导细胞生长停滞、细胞凋亡、DNA修复和分化受损。已经发现的p53靶基因超过16个，但目前仍不清楚哪一个是起决定作用的。p53能激活多条信号途径参与调节细胞凋亡：Fas、PIDD、DR5；Bax、Noxa、p53基因上调凋亡调控因子(the p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)、p53AIP；PIGs；Soctin、PERP、PAG608、Siah；IGF-BP3。关于p53基因如何抑制肿瘤的发展仍是研究的热点。

1 p53的凋亡通路

肿瘤抑制基因p53和原癌基因Bcl-2是p53凋亡通路中两个最早被确定的基因。经研究发现，这两种基因和蛋白之间具有很强的遗传和生理关系。越来越多的报道显示，p53主要通过与Bcl-2家族蛋白相互作用发挥促凋亡与抗凋亡的功能[2]。Bcl-2最初是在非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中分离并命名的。Bcl-2家族成员具有较高的同源性，具有一个或多个Bcl-2的同源性(Bcl-2 homology，BH)结构域(BH1、BH2、BH3、BH4)，可以形成异二聚体。根据作用其可分为两类：①抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL、髓细胞白血病基因1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、Bcl-w、秀丽线虫基因9等；②促凋亡成员，如Bax、Bak、PUMA、Noxa、Bim、Bcl-xs、Bad、Bik、Bid等。抗凋亡和促凋亡家族蛋白之间平衡的改变决定了细胞是否进入凋亡过程。

促凋亡的Bcl-2蛋白家族成员共同含有BH3结构域(BH3-only)，能够编码Bid。接受凋亡信号后，Bid与Bcl-2家族蛋白Bax和Bak相互作用，使Bax蛋白嵌入到线粒体外膜中，增强线粒体外膜的通透性，导致释放细胞色素C和其他促凋亡因子,如第二线粒体衍生的胱天蛋白酶(caspase)激活剂/低等电点凋亡抑制蛋白直接结合蛋白的释放[3]。Bid可诱导Bcl-2或Bcl-xL释放出Bid和Bim促进凋亡。p53蛋白在细胞应急情况下被激活，同样具有BH3-only相似的功能和转录因子作用，p53致Bid的表达上调，调节下游靶基因参与p53介导的细胞凋亡过程调。此外，在细胞凋亡中p53还具有独立的转录作用。p53通过与Bax的相互作用，促进Bax的活化和Bax蛋白插入到线粒体膜中，使线粒体通透性增加。

2 PUMA对于p53凋亡通路的调控

Bcl-2在细胞凋亡调控机制中起着十分重要的作用。实验发现，Noxa和PUMA(bbc3)编码的BH3也较为重要[4-6]。PUMA和Noxa基因的转录均受p53正性调控，参与全部的p53介导的凋亡信号。Noxa由PMAIP1(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酰引导蛋白1)基因编码，具有2个BH3结构域，可以泛素化降解Mcl-1[7]。X射线照射小鼠后可激活依赖p53的凋亡途径，从而诱导Noxa表达。Noxa是唯一编码BH3的Bcl-2家族成员，只具有BH3区域，而没有其他BH域。研究发现，Noxa在非依赖p53的凋亡途径中起重要作用[8]。Noxa通过介导非p53的凋亡过程，经BH3与线粒体和抗凋亡的Bcl-2家族成员相互作用，直接激活Noxa及其他凋亡蛋白，导致caspase-9的激活，但此过程并不会增强PUMA水平。

PUMA是于2001年被发现的一种具有促凋亡作用的p53靶基因，高度保守[9-11]。PUMA在正常状况下低表达，应激后可以迅速诱导激活PUMA，参与p53依赖性和非依赖性细胞凋亡过程，受转录因子调控，而不是翻译后修饰调控。被激活后，PUMA与抗凋亡Bcl-2家族成员相互作用，从而释放Bax和(或)Bak，启动线粒体凋亡信号。线粒体功能障碍将激活caspase级联，最终导致细胞死亡。实验证明，PUMA在DNA损伤激活的p53介导的凋亡途径中更为重要，而Noxa作用相对有限[12]。PUMA具有4种亚型(α、β、γ、δ)，其中γ、δ缺少BH3结构域，无法诱导细胞凋亡[13]。PUMA的促凋亡作用：一方面，PUMA介导p53依赖的所有凋亡信号[14-16]。研究发现，DNA损伤诱导的凋亡过程中，p53和PUMA启动子上p53结合位点的结合是必不可少的[17]。PUMA的启动子具有两个p53结合区，对于PUMA与p53的结合，PUMA的活化至关重要。p53与PUMA启动子的结合有利于核心组蛋白的修饰，如乙酰化组蛋白H3和H4，促进染色质结构开放和转录激活。PUMA基因缺失的动物或细胞，导致p53丧失诱导凋亡功能，而其他的p53靶基因(如Bak基因)缺失，不会阻碍p53的诱导凋亡作用。小鼠实验证实，尽管仅剔除PUMA能够抵制etoposide(拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙苷)与γ射线的促凋亡作用，不会使淋巴细胞死亡，但Noxa或PUMA的任何一个因子的降解都会减少成纤维细胞中由于DNA降解引起的细胞凋亡[14]。另一方面，PUMA可介导p53非依赖的凋亡信号[18-20]。缺少PUMA，人结肠癌细胞的p53依赖凋亡过程被抑制。缺失PUMA的淋巴细胞还可以抵制细胞因子缺失、地塞米松、星形孢菌素引发的凋亡过程[21-24]。PUMA诱导细胞凋亡可通过激活多种凋亡蛋白如Bax和(或)通过其抗凋亡的Bcl-2家族成员，从而引发线粒体功能障碍和caspase激活。PUMA也可以直接激活Bax/Bak或细胞质的p53诱导的线粒体功能障碍，使细胞进入凋亡途径。此外，PUMA也是内质网应激标志分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白的下游分子，介导内质网应激途径诱导的细胞凋亡，并通过调控内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78的表达，参与内质网应激途径诱导的细胞凋亡[25-26]。

3 MCL-1对于p53凋亡通路的调控

研究显示，PUMA对于细胞凋亡发挥着重要作用，它除了受p53的调控，还受其他因子的调节，如MCL-1[27-28]。MCL-1属于抗凋亡Bcl-2家族蛋白的一员，通过不同的剪接方式可生成两种变体：选择性剪接较长的变体(异构体1)可通过抑制细胞凋亡，提高细胞的存活；而剪接较短的变体(异构体2)则促进细胞凋亡和死亡诱导。MCL-1可以作为上游的分子，通过阻止细胞色素C的释放从而阻断多种凋亡诱导剂所诱导的细胞凋亡，然而MCL-1抑制细胞凋亡的分子机制尚未阐述清楚。研究显示，缺失MCL-1可以破坏p53-Bak复合物的形成，过表达MCL-1可以促进恶性肿瘤细胞生存[29]。MCL-1是一个很不稳定的蛋白质，它的快速诱导表达和降解表明，它在细胞为适应周围环境迅速变化的凋亡调控中具有重要作用。其蛋白表达水平受到极其严格而复杂的调控，提示其在细胞受到应激发生变化时，对细胞的存活与否发挥着关键作用。

4 MCL-1与PUMA在p53凋亡通路中的作用

MCL-1可以直接或间接地激活Bcl-2家族促凋亡蛋白Bak与Bax抑制细胞凋亡。MCL-1通过与Bim或Bak形成异源二聚体中和凋亡蛋白的作用，抑制细胞色素C的释放及细胞凋亡。MCL-1可以通过BH1结构域和PUMA的BH3结构域相互作用，在内质网应激过程中抑制MCL-1可以通过上调PUMA来激活Bak与Bax。另外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体可以通过死亡受体途径激活caspase-8和caspase-3，而活化的caspase-8或caspase-3可以切割抗凋亡的MCL-1，当MCL-1被切割后，将阻止与促凋亡的Bcl-2家族成员(如Bim)间形成复合体，最终通过线粒体途径导致细胞凋亡[26,30-31]。免疫荧光实验显示，MCL-1和PUMA共同定位于线粒体，表明MCL-1和PUMA在线粒体上结合[32]。进一步研究发现，MCL-1可以抑制PUMA诱导的细胞凋亡，且MCL-1的BH1结构域对于其抗PUMA诱导的细胞凋亡起着重要的作用[33]。MCL-1的蛋白稳定性可以被PUMA提高，而且这种MCL-1蛋白稳定性的提高是由于和PUMA的直接结合所致。研究显示，将PUMA的BH3结构域去除之后，PUMA失去提高MCL-1蛋白稳定性的功能；同时也证明了PUMA结合MCL-1只能部分阻止MCL-1的快速降解，提示除了PEST(为一富含脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的约10个氨基酸组成的结构序列)和BH1结构域介导MCL-1的快速降解，还存在其他降解信号，而且位于MCL-1蛋白的C末端[34]。该项研究阐明了Mcl-1可以与PUMA相互作用，而且提示MCL-1可能通过与PUMA结合而提高自身稳定性，最终行使抗凋亡的功能[35-36]。在紫外线诱导的细胞凋亡过程早期，p53能被激活，并作为一个转录因子，诱导多种与凋亡相关蛋白的表达。细胞接受凋亡刺激后，胞内p53水平增加，进入胞质p53与MCL-1竞争结合Bak，使MCL-1释放Bak，引起Bak寡聚化，MCL-1缺乏。Bak的寡聚化能增加线粒体外膜通透性，最终激活线粒体途径的细胞凋亡[37]。

作为一种肿瘤抑制基因，p53的主要功能是调节细胞生长停滞和凋亡，通过平衡这两种细胞的生命活动，最终决定细胞的命运。不同于其他的肿瘤抑制基因，大多数肿瘤中的p53突变的错义类型，会导致单个氨基酸的变化，影响蛋白质上的DNA结合域，表明与DNA序列特异性结合是抑制p53活性与逃脱肿瘤命运的关键。

5 小 结

p53被证明在多种凋亡刺激所诱导的细胞凋亡过程发挥着关键的作用，但是它的诱导凋亡的潜在机制还不明确。随着研究的深入，人们发现p53的下游分子PUMA诱导凋亡功能十分重要，具有重要的促凋亡作用。通过诱导细胞色素C从线粒体释放，激活caspase-9从而引发凋亡。PUMA的缺失能够阻碍DNA损伤，激活p53引发的凋亡过程。此外，PUMA的缺失也可以抑制多种凋亡因子的诱导凋亡途径。p53的另一个下游分子MCL-1是一个抗凋亡分子，通过抑制细胞色素C从线粒体释放，抑制caspase-9，从而阻碍凋亡的发生。Mcl-1与PUMA可以在线粒体通过Bcl-2家族蛋白的BH结构域(BH1与BH3)发生相互作用，通过相互作用可以提高Mcl-1的稳定性，最终抑制细胞的凋亡途径。当细胞受到刺激损伤时，会引发p53的凋亡通路，p53通过PUMA促进细胞凋亡；如果细胞癌变，则细胞就会逃离凋亡的命运，p53可能会通过调节Mcl-1的活性，阻碍细胞的凋亡过程，但具体机制尚不清楚，有待进一步的研究。

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