建立大鼠C6胶质瘤模型及相关因素分析

刘 刚LIU Gang

孙国臣2SUN Guochen

李美容3LI Meirong

李 颖1LI Ying

马 林1MA Lin

建立大鼠C6胶质瘤模型及相关因素分析

刘 刚1LIU Gang

孙国臣2SUN Guochen

李美容3LI Meirong

李 颖1LI Ying

马 林1MA Lin

目的建立大鼠C6胶质瘤模型，探索胶质瘤模型建立的实验步骤、方法及关键点。材料与方法大鼠C6胶质瘤细胞体外培养、传代至对数生长期，离心、计数，调节细胞浓度为1×105/μl。应用大鼠立体定位仪，以右侧尾状核头为靶区，注入Wistar大鼠脑内，3 d后行MRI扫描观察脑内成瘤情况。本实验共接种8批次50只Wistar大鼠。结果第1～5次共接种24只Wistar大鼠，接种后第1、2天意外死亡2只，其余22只大鼠MRI扫描可见肿瘤生长，成瘤率高。第6、7次以同样方法及条件接种20只大鼠，MRI扫描证实仅有5只大鼠成瘤。第8次更换肿瘤细胞后接种6只大鼠，均成瘤。结论肿瘤是否成瘤与细胞选择密切相关，要选择新近诱导出的大鼠胶质瘤细胞，以保证细胞的抗原性，是提高成瘤率的关键。

脑肿瘤；神经胶质瘤；肿瘤，实验性；磁共振成像；立体定位技术；疾病模型，动物；大鼠，Wistar

脑胶质瘤是发病率最高的颅内原发肿瘤，其发病率达35%～60%，临床治疗效果不佳，预后较差[1]。建立稳定可靠的动物模型是研究脑胶质瘤发病机制及治疗方法的关键。动物胶质瘤模型的实验研究已广泛开展，由于实验条件及经济等原因，多选择大鼠胶质瘤模型[2-5]。C6胶质瘤细胞系来源于Wistar大鼠，故胶质瘤模型选择Wistar大鼠较为适宜。本研究拟建立与人胶质瘤相近似的大鼠C6胶质瘤模型，分析保证成瘤率的相关因素，为胶质瘤的诊断及治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠50只，购自北京维通利华实验动物公司[动物许可证号SCXX（京）2006-000]，均为雄性，体重200～250 g。动物实验及饲养均在解放军总医院动物研究中心完成，清洁级动物实验室，严格无菌操作。

1.2 细胞培养 大鼠C6胶质瘤细胞（由北京天坛医院神经放射科惠赠）于10%小牛血清DMEM完全培养液中培养，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，于接种前再传代一次，24 h后更换1次培养液。在细胞于对数生长期约80%满时，以0.25%胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，以Hank液吹打冲洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为1×105/μl，置于4℃冰箱中待接种，采用台盼蓝排斥实验检测细胞活性＞95%。

1.3 细胞植入 脑内立体定向接种10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射，完全麻醉后，剪去头顶部的毛发，用碘酒消毒后铺无菌巾。用脱毛膏脱毛后，以内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向剪开头皮约1.5 cm，分离暴露颅骨，根据Bather法确定右尾状核靶点于冠状缝后1 mm，矢状缝右3 mm，用牙科钻开颅。在大鼠立体定位仪头架上固定大鼠，以10 μl微量注射器抽取C6细胞悬液10 μl（含有1×106个细胞），于骨孔缓慢垂直进针至硬膜下约6 mm，再回退1 mm（距硬膜下5 mm），设置制动进液器注射速度为1 μl/min，共注射10 min，注射完毕后留针10 min，缓慢拔针，用骨蜡封闭骨孔。以生理盐水冲洗手术野，用4号线缝合切口。术后单笼饲养。本实验共接种大鼠8批次。

2 结果

2.1 大鼠存活及成瘤情况 第1～5次共接种24只Wistar大鼠，接种后第1天及第2天意外死亡2只，其余22只大鼠MRI扫描均可见肿瘤生长，成瘤率高达91.7%（图1A～C）。观察大鼠行为变化，接种后第1～7天，大部分大鼠一般状况无明显变化，少数可出现体重下降；第8～14天，大鼠逐渐精神萎靡不振，活动量减少，食物和水的摄入减少，皮毛失去光泽，毛发枯黄，体重明显减轻；第15～21天上述症状进行性加重，生存状态极差，皮毛枯燥发黄，拒食水，对外界刺激反应极差，部分大鼠癫痫发作，萎靡不振，陆续死亡。肿瘤消退，存活2只。第6、7次以同样方法及条件接种20只大鼠，1只死亡，MRI扫描证实仅有5只大鼠成瘤，其余均未成瘤。第8次更换肿瘤细胞后，以同样操作方法接种大鼠6只，MRI扫描证实均成瘤。

成瘤大鼠3～5 d后MRI扫描可见点状或小结节样强化；10 d左右肿瘤迅速生长；至15～20 d，肿瘤可生长至占大脑半球的2/3，大鼠一般状况迅速恶化，随时死亡。

2.2 病理表现 大鼠处死后病理切片行HE染色，镜下可见肿瘤组织内细胞排列紊乱，细胞形态不规则，有较多核分裂象，核异型性明显，符合高级别胶质瘤改变（图1D、E）。

图1 大鼠C6胶质瘤细胞植入第11天，MRI扫描示肿瘤生长，位于右侧基底节区。T2WI示肿瘤呈长T2高信号（箭，A）；T1WI示肿瘤呈稍长T1稍低信号（箭，B）；T1WI增强扫描示注入Gd-DTPA后肿瘤呈较均匀显著强化（箭）肿瘤位于右侧基底节区，呈长T1长T2信号，增强扫描呈明显均匀强化（C）；全脑大体标本（HE, ×2, D）及肿瘤与正常组织交界处（HE, ×200, E）镜下见肿瘤组织内细胞排列紊乱，细胞形态不规则，有较多核分裂象，核异型性明显，符合高级别胶质瘤改变

3 讨论

建立与人脑恶性胶质瘤存在相似生物学特征的大鼠C6胶质瘤模型是动物研究的关键。以往C6细胞脑内胶质瘤模型多采用SD大鼠，SD大鼠与Wistar大鼠属于不同的种群，遗传性状有明显改变，C6细胞接种到SD大鼠脑内后，肿瘤生长相对缓慢，瘤组织与脑组织有明显的分界，这与人脑恶性胶质瘤的生长特点有较大差异。近年来，C6大鼠脑胶质瘤细胞系是经N2亚硝基甲脲（N-nitrosomethylurea）诱发Wistar种系大鼠获得的肿瘤细胞[6,7]，接种到同种系Wistar大鼠脑内，肿瘤生长快，病理切片示肿瘤细胞浸润生长，与正常脑组织无明显分界，与人脑胶质瘤的侵袭性生长相近似。C6细胞起源于Wistar大鼠，更适用于胶质瘤的实验治疗研究[8,9]。本研究表明，C6大鼠胶质瘤模型生存期一般为细胞种植后10～20 d，20 d之后由于肿瘤生长过大，大鼠随时死亡，设计实验时，需注意时间因素[10,11]。

本研究前5次接种，存活大鼠全部成瘤，存活、成瘤率达91.7%（22/24）。实验中发现有2只大鼠肿瘤自然消退，消退率为8.3%（2/24），肿瘤自然消退现象曾见报道[12]，可能与组织排异反应、移植感染或细胞系退化等有关，当时未予以重视。第5次肿瘤细胞接种结束后，细胞冻存。约2个月后复苏、传代，进行第6、7次接种，采用同样方法及实验条件，共接种20只，意外死亡1只，5只大鼠成瘤，其余均未成瘤。如此大规模的种瘤不成功，引起笔者的关注和思索，根据以往报道及与其他单位研究者的探讨，同一批接种大鼠，可有个别不成瘤的情况，其可能的原因为出血、细胞种植入脑室或蛛网膜下腔内感染等，但不会有如此高的未成瘤率。分析得出可能原因为C6细胞的抗原性或细胞系退化。尽管每次接种前均由台盼蓝实验确定细胞活性＞95%，但细胞活性仅仅代表细胞存活。细胞系的退化及抗原性下降可能是解释的唯一原因。回顾前一批接种曾有2只大鼠成瘤后肿瘤自然消退，这种现象报道较少，可能提示细胞系退化。所用的C6细胞为受赠于外院的冻存细胞，已经过多次传代，接种过5次后（平均每次接种需传代2～3次），存在细胞系退化、抗原性下降的可能。未见文献报道相关因素，可能与细胞传代50次后细胞抗原性下降有关，这种结果尚未见报道。第8次接种，C6细胞为新近诱导出的肿瘤细胞，接种6只，均成瘤。

大鼠C6胶质瘤模型的建立以往报道着重于操作步骤的差异，随着研究的深入，操作步骤及流程均已达成广泛的一致，但对于肿瘤细胞多次传代后抗原性下降导致成瘤率低这一因素尚未见报道。本研究结果证实，应选择新近诱导出的肿瘤细胞以保证较高的成瘤率。

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（责任编辑 张春辉）

Establishment of Rat C6 Glioma Model and Analysis of Relevant Factors

PurposeTo explore the procedure, method and key factors in establishing rat glioma model.Materials and MethodsC6 glioma cells were cultured in vitro to exponential phase. The cells were centrifuged and adjusted to the concentration of 1×105/μl, and then implanted into the right caudate head in Wistar rats using stereotaxic positioner. MRI was performed in three days to evaluate tumor formation. Fifty rats were inoculated in eights batches.ResultsIn the frst fve batches, 24 Wistar rats were injected. Two rats died on day 1 and 2. In the remaining 22 rats, tumors were demonstrated on MRI indicating high tumor formation rate. Twenty rats were injected in batch 6 and 7 with tumor formation in only 5 rats on MRI. In batch 8, new C6 tumor cells were used with tumor formation in all 6 rats.ConclusionSuccessful tumor growth is closely related to cell selection. Recently inducted C6 rat glioma cells are crucial to maintain antigenicity and tumor formation.

Brain neoplasms; Glioma; Neoplasms, experimental; Magnetic resonance imaging; Stereotaxic techniques; Disease models, animal; Rats, Wistar

1.解放军总医院放射诊断科 北京 100853

2.解放军总医院神经外科 北京 100853

3. 解放军总医院基础医学研究所 北京100853

马 林

Department of Radiology, Chinese PLA General Hospital , Beijing 100853, China

Address Correspondence to: MA Lin

E-mail: cjr.malin@vip.163.com

国家自然科学基金面上项目（30970816）。

R-33；R445.2

2013-12-24

修回日期：2014-04-22

中国医学影像学杂志

2014年 第22卷 第5期：329-330，335

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(5): 329-330, 335

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.05.003