乳腺癌HER2靶向分子探针的制备及体外MRI初步研究

朱 媛ZHU Yuan

段小艺1DUAN Xiaoyi

王瑞峰1WANG Ruifeng

樊钢练2FAN Ganglian

郭佑民1GUO Youmin

乳腺癌HER2靶向分子探针的制备及体外MRI初步研究

朱 媛1ZHU Yuan

段小艺1DUAN Xiaoyi

王瑞峰1WANG Ruifeng

樊钢练2FAN Ganglian

郭佑民1GUO Youmin

目的以乳腺癌表皮生长因子受体2（HER2）为靶点，制备以顺磁性粒子钆为载体的MR分子探针，通过MR靶向成像为乳腺癌个体化治疗提供影像学依据。材料与方法利用课题组前期制备的针对HER2的荧光标记探针FITC-LTVSPWY与钆喷替酸葡甲胺（Gd-DTPA）耦联获得MR靶向探针。以表达HER2阳性的人乳腺癌细胞SKBR3、MCF-7及HER2阴性的MDA-MB-231细胞为观察对象，加入靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA共同孵育作为实验组，细胞加入Gd-DTPA作为对照组，不添加任何探针的细胞作为空白组，利用MRI行体外细胞成像；T1WI序列采集图像，进行视觉分析与比较各组细胞MRI信号。结果细胞体外MRI结果显示，实验组细胞T1WI呈高信号，对照组与空白组细胞均呈等信号，且存在视觉差异。结论课题组构建的以HER2为靶点的MR分子探针具有良好的磁学特性，体外可以与HER2阳性乳腺癌细胞特异性地结合，为体内成像研究奠定了基础。

乳腺肿瘤；靶向探针；钆；表皮生长因子受体；磁共振成像

分子成像在恶性肿瘤的个体化治疗方面具有潜在的发展与应用前景。人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）在20%～30%的乳腺癌中呈过表达，其表达水平与患者的预后密切相关[1,2]。目前，曲妥珠单抗、拉帕替尼等[3,4]多种针对HER2的靶向治疗药物已经应用于临床，并取得了良好的效果。肿瘤患者能否应用靶向治疗药物、治疗效果如何在很大程度上依赖于肿瘤组织HER2的表达与否及表达水平的高低[5-7]。因此，治疗前与治疗过程中监测HER2在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达水平对于合理制订治疗方案至关重要。本研究尝试将临床最常用的MR阳性对比剂钆喷替酸葡甲胺（Gd-DTPA）与针对HER2的寡肽分子LTVSPWY耦联制备MRI靶向探针，检测此探针的物理与磁学特性，通过体外细胞成像观察探针的靶向性，为MRI靶向成像的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Gd-DTPA为爱尔兰Amersham Health公司产品，荧光素标记的针对HER2的七肽分子FITCLTVSPWY由苏州特瑞药业有限公司负责合成，荧光显像使用日本Olympus公司的倒置荧光显微镜。细胞培养瓶及培养皿为美国Fisher Scientifc公司产品。DMEM培养液及胎牛血清购自美国Hyclone公司，采用美国GE公司的HDx 3.0T MRI仪。其余实验材料均为美国Sigma公司产品。表达HER2的人乳腺癌细胞株SKBR3、MCF-7及HER2表达阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231由西安交通大学第一附属医院转化医学中心刘培军教授惠赠。

1.2 制备靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA 取0.2 ml过碘酸钠（NaIO4）干燥粉末溶于11.1 mg蒸馏水中，充分混匀；取1 ml Gd-DTPA加入NaIO4溶液，室温下摇匀并放置30 min，随即加入1 ml乙二醇还原液，摇匀，室温放置30 min后加入5 mg FITCLTVSPWY，混匀过夜，取1 mg硼氢化钠干燥粉末溶于100 μl蒸馏水中，混匀后加入上一步制备的溶液中，于4℃冰箱放置2 h，即获得靶向分子探针FITCLTVSPWY-Gd-DTPA。

1.3 琼脂糖凝胶电泳分析 灌制1%琼脂糖凝胶，分别加入3 μl靶向分子探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA和非靶向探针FITC-LTVSPWY进行琼脂糖凝胶电泳分离，电压70 V，电泳时间60 min。

1.4 靶向探针弛豫率检测 将FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA和Gd-DTPA以 浓 度 为6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml分别溶于去离子水中，采用腕关节线圈，运用后台感兴趣区测量工具测出T1值，计算弛豫率。扫描参数：视野120 mm，矩阵256×128，层厚1.5 mm，TE7.8 ms，TR3000 ms，层间距0，翻转角90°，采集次数4次，扫描时间15～20 min。

1.5 乳腺癌细胞爬片的制备与荧光染色 用89% DMEM、10%胎牛血清和1%抗生素培养基培养HER2表达阳性的乳腺癌细胞MCF-7，待其生长至对数生长期，用1 ml 0.25%胰酶消化3 min后，再用含胎牛血清的培养基中和，调整细胞浓度至1×105/ml。将细胞接种于载玻片上孵育24 h，待细胞贴壁后用丙酮固定30 min，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5次、每次5 min后备用。将5 mmol/L FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA滴至制备好的乳腺癌细胞爬片上，37℃孵育30 min，用PBS反复冲洗后于倒置荧光显微镜下观察细胞表面的荧光分布。

1.6 细胞体外MRI 于培养瓶中培养HER2表达阳性的人乳腺癌细胞SKBR3、MCF-7及HER2表达阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231，待细胞均生长至对数生长期时，分别加入30、60、120、240 nmol/ml靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA作为实验组和非靶向探针Gd-DTPA作为对照组，以不添加任何探针的细胞作为空白组，每组3个平行管。将各组细胞37℃孵育一定时间后弃去培养基，PBS冲洗3次，每次5 min后用胰酶消化3 min，再以800 r/min离心5 min，在所得细胞团块内加入1%琼脂糖和800 μl PBS充分混匀，装入1.5 ml EP管中，进行MRI。采用腕关节线圈，选择快速自旋回波序列进行T1WI扫描，扫描参数：TR 440 ms，TE 149 ms，视野 60 mm，层厚2 mm，无间距扫描，矩阵256×192，采集次数 4，翻转角90°。由2名MRI主任医师采用双盲法观察并确定各组细胞T1WI信号的差异，意见不一致时协商达成一致。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳分析结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示，非靶向探针Gd-DTPA条带迁移速度较快，形成较亮片段；靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA条带基本未迁移，见图1。由此证明两种探针的分子量及电荷均不同。

图1 琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为非靶向探针Gd-DTPA，迁移速度较快，形成高亮片段；泳道2为靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA，条带处于初始孔，基本未迁移

2.2 探针弛豫率检测与荧光染色结果 MRI结果显示随着溶液中Gd离子浓度的增高，T1WI序列的弛豫时间变短，信号变亮。运用后台程序测量各管的T1值计算出Gd-DTPA和FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率分别为4.560 L/(mmol-s)和5.330 L/(mmol-s)。制备的MCF-7细胞爬片显微镜下示细胞分布均匀，形态结构清晰，生存状态良好（图2）。与靶向探针FITCLTSPWY-Gd-DTPA共同孵育后于倒置荧光显微镜下观察细胞形态良好，分布均一，细胞膜表面清晰，可见均匀分布的绿色荧光，细胞内荧光较弱（图3），由此证明靶向探针FITC-LTSPWY-Gd-DTPA可以与膜受体HER2特异性地结合。

图2 倒置显微镜下观察MCF-7细胞爬片，细胞形态结构清晰，状态良好，分布均匀

图3 荧光显微镜下观察MCF-7细胞爬片与靶向探针孵育结果，绿色荧光均匀分布于细胞表面，细胞内较弱，证明靶向探针可以与HER2阳性细胞特异性地结合

2.3 细胞MRI结果 实验组、对照组与空白组细胞经MRI扫描示靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA处理的HER2表达阳性的SKBR3与MCF-7细胞在同一TE下均呈明显短T1高信号，2种细胞的信号视觉差异不明显，而HER2表达阴性的MDA-MB-231细胞经靶向探针处理后在同一TE下呈等T1信号，其与HER2表达阳性细胞的MR信号有明显的视觉差异；非靶向探针Gd-DTPA处理的对照组3种细胞均呈T1稍高信号，细胞间视觉差异不明显；空白组及背景琼脂糖MR扫描均呈T1等信号，不同种类细胞间的信号强度差异不明显（图4、5）。每组设立的3个平行管之间信号均无明显视觉差异。

图4 HER2高表达的SKBR-3细胞、中等表达的MCF-7细胞和HER2阴性的MDA-MB-231细胞的T1WI结果。同一种细胞靶向探针呈明显高信号，非靶向探针呈稍高信号，空白组呈等信号

图5 不同浓度探针与SKBR3细胞的体外T2WI图。在同一探针浓度下，靶向探针呈明显高信号，非靶向探针呈稍高信号，空白组呈等信号。同一组内，随着探针孵育浓度的增大，信号逐渐增强

3 讨论

肿瘤标志物靶向治疗药物的选择与个体化治疗一直是研究的热点问题[8]。与大分子抗体相比，小分子多肽具有分子量小、易穿透肿瘤组织、不产生机体免疫反应及便于修饰改造等优点，更具有发展与应用前景[9,10]。LTVSPWY是Shadidi等[11]通过噬菌体库筛选技术筛选出的一种针对HER2包含7个氨基酸的短肽。Wang等[12]证实通过将LTVSPWY与α-TOS结合，可以使MDA-MB-453细胞出现明显凋亡，为制备LTVSPWY与MR顺磁性分子耦联物用于MR靶向成像提供了理论依据。

Gd-DTPA是经美国FDA批准并广泛应用于临床的成熟的MR阳性对比剂，属于细胞外间隙造影剂，在低浓度状态时对机体T1弛豫时间影响较大，通过缩短氢质子的弛豫时间而影响被引入组织的T1弛豫时间，且GdIII与DTPA螯合后可以减少其在体内的毒副作用[13-15]。然而，Gd-DTPA血浆渗透压较大，进入机体后在动脉相能够快速进入细胞外间隙，浓度达到峰值而使组织背景信号增强，当细胞间隙对比剂浓度降低时，T1WI信号强度随之衰减。在整个MRI增强扫描过程中，钆对比剂仅在动脉、毛细血管网、细胞外间隙和静脉内存在，不能进入细胞内，因而无法实现针对病变组织的靶向成像[15-17]。基于此，课题组计划选择能与HER2特异性地结合的七肽小分子LTVSPWY与顺磁性粒子Gd通过DTPA连接后获得具有成像靶向性的MR分子探针。

在制备靶向探针前，为了进一步证明七肽分子LTVSPWY具有针对HER2的靶向性，本研究采用荧光标记LTVSPWY，与HER2高表达乳腺癌细胞共同孵育后，在荧光显微镜下观察到乳腺癌细胞表面均匀分布的绿色荧光，从而进一步证实了LTVSPWY对HER2的靶向性。

DTPA是常用的耦联剂，研究中先经NaIO4将DTPA的氨基氧化为醛基，再使醛基与酪氨酸的氨基反应生成shifft碱，生成物化学性质稳定，且该反应在液相一步合成，操作简单，耦联效率高。琼脂糖凝胶电泳结果显示所制备的靶向探针符合预期分子量。在MRI仪下检测靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率高于非靶向探针Gd-DTPA，其原因在于靶向探针分子量大，侧链增长后分子体积变大，使分子旋转相关时间延长，从而使弛豫率增加。理论上弛豫率越大，对比性越好，成像效果越佳。进一步对HER2表达阳性的肿瘤细胞进行MR体外成像，结果显示同一种细胞在同一TE下，加入靶向探针的2种乳腺癌细胞的T1弛豫时间较加入非靶向探针的肿瘤细胞明显缩短，呈高亮信号。经非靶向探针Gd-DTPA处理过的细胞T1WI呈稍高信号，可能是由于Gd-DTPA沉积在细胞间隙未能被PBS彻底洗涤所致。

此外，作为探索性研究，本实验未探讨探针浓度、成像时间及肿瘤HER2表达水平与MRI信号之间相关性，需在后续实验中进一步深入研究课题。

总之，本课题组通过耦联技术自行制备的MR靶向探针具有良好的物理和磁学特性，体外细胞成像显示出针对乳腺癌HER2靶向成像效果，为下一步进行体内成像研究奠定了基础。

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（责任编辑 张春辉）

Preparation of HER2-targeted Molecular Probe and Its MR Imaging in Vitro

PurposeTo prepare human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-targeted MR molecular probes with paramagnetic particle gadolinium as carrier, and to provide imaging data for individualized treatment of breast cancer through its targeted MR imaging.Materials and MethodsThe HER2-targeted molecular probe was made by conjugating fuorescent labeling probe FITC-LTVSPWY and Gd-DTPA prepared by our research group earlier. Positive expressions like human breast cancer cell SKBR3 and MCF-7 and negative expression like MDA-MB-231 were selected as observe objects. Those cells incubated with FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA were taken as experimental group, those with Gd-DTPA as control group, and those without any probe as blank control group. Then MRI was performed in vitro and T1WI signal of cells was collected and assessed visually.ResultsThe strong signals on T1WI were observed in the experimental group, the control group and the blank control group both showed iso-intense signals, and visual difference could be detected.ConclusionThe HER2-targeted MR probe prepared by our research group shows good magnetic features. It can target HER2 in the detection of breast cancer cells in vitro, which can be used in further research on imaging in vivo.

Breast neoplasms; Targeted probe; Gadolinium; Human epidermal growth factor receptor; Magnetic resonance imaging

1. 西安交通大学第一附属医院PET/CT室陕西西安 710061

2. 西安交通大学第一附属医院医学影像科陕西西安 710061

段小艺

Department of PET/CT, the First Affliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China

Address Correspondence to: DUAN Xiaoyi

E-mail: duanxiaoy@mail.xjtu.edu.cn

国家自然科学基金面上项目（81171397）。

R-33；R445.2

2013-12-04

修回日期：2014-03-20

中国医学影像学杂志

2014年 第22卷 第4期：336-339

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(4): 336-339

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.05.005