冷保存移植肝胆管增生的剪切波弹性成像评估：动物实验研究

徐清华XU Qinghua

罗渝昆1LUO Yukun

王洪东2WANG Hongdong

唐文博1TANG Wenbo

吕发勤1LV Faqin

唐 杰1TANG Jie

论著 Original Research

冷保存移植肝胆管增生的剪切波弹性成像评估：动物实验研究

徐清华1XU Qinghua

罗渝昆1LUO Yukun

王洪东2WANG Hongdong

唐文博1TANG Wenbo

吕发勤1LV Faqin

唐 杰1TANG Jie

目的通过建立移植肝胆管损伤模型，探讨超音速剪切波弹性成像评价移植肝冷保存损伤后胆管再生能力的价值。材料与方法96只成年雄性大鼠随机分为两组，实验组48只，24只供体，24只受体，供肝4℃保存12 h后移植；对照组48只，24只供体，24只受体，常规肝移植。每组大鼠随机分为3个亚组，分别于术后1周、2周、4周进行超声弹性成像检查，并取肝脏标本行病理检查，比较各组肝脏弹性指数及实验组各亚组的门管区平均胆管数量。结果实验组大鼠肝移植术后1周、2周、4周较对照组肝脏弹性指数明显升高（F=89.98, P＜0.01），实验组1周与2周、2周与4周组间肝脏弹性指数差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组术后2周、4周时肝脏弹性指数与肝脏门管区胆管增生数量呈显著正相关（r=0.898, P＜0.01）。结论肝移植术后肝脏弹性指数的改变与胆管增生数量显著相关，在评估肝移植术后胆管增生方面具有一定的应用价值。

肝移植；超声检查；弹性成像技术；低温保存；胆管，肝内；增生；大鼠

胆道并发症是原位肝移植（orthotopic liver transplantation, OLT）术后面临的主要问题，严重影响患者术后生存及生活质量[1]。供肝冷保存过程中供肝均存在胆管上皮丧失或受损，其再生能力的损伤是导致胆管并发症的关键因素[2]。然而，目前尚没有无创性地预测及判断胆管再生情况的较好方法[1]。超音速剪切波弹性成像可以用于测定肝脏弹性指数（liver stiffness, LS），该指数与纤维含量呈显著正相关，可以用于临床中对肝脏纤维化的诊断[3-5]。胆管增生过程中伴随的胆管周围纤维化[6]以及移植肝冷保存损伤后继发的胆管纤维化[7]很可能导致LS升高，因此，LS可以用于评估胆管再生情况。本实验研究通过建立移植肝胆管损伤模型，探讨LS评估胆管再生情况的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康清洁级成年雄性SD大鼠96只，购自解放军总医院实验动物中心[合格证号：SCXK-（军）20070004]，体重250～320 g，饲养环境为清洁级，每笼4～5只，温度为（23±3）℃，湿度为50%～70%，自然昼夜节律采光，饲养、换水由专人负责。96只大鼠随机分为对照组和实验组，每组供体、受体各24只。

1.2 肝移植手术方法 所有大鼠术前12 h禁食，采用乙醚吸入麻醉，取仰卧位，腹部正中切口。肝移植手术在OLT方法的基础上[8]加以改良，即置入支架以重建肝动脉[9]。实验组采用冷保存肝移植[10]的方法，对照组行常规肝移植。供体手术：游离供肝。肝下下腔静脉及门静脉修剪后置入血管袖套，用9/0丝线结扎固定。肝动脉及胆管置入支架备用。实验组供肝于器官保存液中4℃冰箱保存12 h，对照组即刻进行供肝植入。供肝植入：受体移除肝脏。肝上、下腔静脉用8/0血管线连续缝合。肝下下腔静脉、门静脉、肝总动脉及胆管内支架分别用9/0丝线环扎固定。术后单独置于笼中，对受体进行复温。

1.3 超声弹性成像检查 每组大鼠随机分为3个亚组，分别于术后1周、2周、4周行超声弹性成像。采用法国SuperSonic Imagine公司AixPlorer实时剪切波弹性成像超声诊断仪，探头频率15 MHz。弹性成像检查彩色编码范围选取0～50 kPa，Q-BOX测量直径10.0 mm。每次弹性测定取连续4帧图像，测量后取其平均值记为该次弹性成像检查的LS。

1.4 病理检查 超声弹性成像测定后处死所有大鼠，取肝脏标本经福尔马林溶液固定，石蜡包埋。病理切片由1名经验丰富的病理科医师阅读。参照Toki等[11]的方法，通过门管区平均胆管数量的计数进行胆管增生程度的定量评估。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，不同组及不同时间点大鼠LS比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，LS与门管区胆管数量之间的相关性采用Spearman相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠术后存活情况 实验组大鼠术后1周、4周组各有1只大鼠因弹性测量前麻醉过深死亡，对照组大鼠术后全部存活。两组大鼠术后1周、2周、4周存活率比较见表1。

表1 实验组与对照组大鼠术后存活情况[n(%)]

2.2 LS测定 所有大鼠均成功进行LS测定（图1B～D）。肝移植术后1周、2周、4周，实验组LS明显高于对照组，差异有统计学意义（F=89.98, P＜0.01），实验组中肝移植术后1周与2周组间、2周与4周组间LS比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 病理结果 实验组及对照组大鼠术后1周时，肝细胞体积增大，胞质淡染，细胞空泡化，门管区有多量炎症细胞浸润。对照组在肝移植术后2周、4周肝小叶、门管区结构清晰，无明显炎症细胞浸润及胆管增生。实验组肝移植术后2周时，门管区扩大但无纤维隔形成。肝移植术后4周时，门管区可见胆管增生较多。实验组1周、2周、4周中位胆管增生数量分别为1.8（1.7～2.0）、19.0（14.0～24.0）、31.0（17.8～35.0），见图1A～C。

2.4 LS与胆管增生数量的相关性 实验组术后2周、4周时LS与胆管增生数量呈显著正相关（r=0.898, P＜0.01），见图3。

图1 实验组大鼠肝移植术后2周，门管区扩大、胆管增多，但无纤维隔形成，箭示门管区胆管增生（HE, ×400, A）；超声弹性成像示肝移植术后2周LS为14.72 kPa（B）；肝移植术后4周，门管区可见胆管增生较多（箭，C）；超声弹性成像示肝移植术后4周LS为26.54 kPa（D）

3 讨论

肝移植术后的胆道并发症是影响患者预后的重要因素，而胆管增生不足是其发生的关键[1,2]，因此，评估肝移植术后的胆管再生情况具有重要意义。然而，目前在评估胆管再生情况方面主要依赖组织学检查，尚无理想的无创性方法[1]。由于肝脏组织活检的有创性、取材有限性、可重复性差及术后并发症，使得胆管增生的评估受到限制[1,12]。

图2 对照组与实验组不同时间LS比较。*P＜0.01，**P＜0.05

肝脏超声弹性测量作为一种新兴技术具有无创、操作简便、可重复性好等优点。自2003年超声弹性成像首次应用于肝脏，目前国内外已有大量研究证明LS与肝脏纤维化等级呈显著相关[3-5]。剪切波弹性成像是基于声辐射力与超速的超声成像序列的一种技术，具有成像迅速、稳定的优势，已在肝脏纤维化分级方面得到了深入而广泛的研究与应用[13]。剪切波弹性成像可以较准确地评估肝脏弹性，与肝脏纤维化程度密切相关[14]。鉴于胆管增生过程中出现的胆管周围的纤维沉积[6]及移植肝冷缺血损伤后胆管纤维化的发生[7]，这种变化很可能导致LS升高。因此，LS可以用于评估胆管再生情况。

本实验研究中，病理结果显示实验组有不同程度的小胆管增生，而对照组均未发现小胆管增生，同时对肝移植术后2周、4周组LS分析发现，实验组LS明显高于对照组，对照组与实验组术后2周LS分别为（6.16±0.51）kPa、（11.68±1.54）kPa，术后4周分别为（6.08±0.60）kPa、（25.46±4.01）kPa（F=89.98, P＜0.01），而且LS与胆管增生数量呈显著正相关（r=0.898, P＜0.01），提示LS可以评估胆管增生情况。

既往研究证实，丙型肝炎复发[15]、肝纤维化[13]、排异反应及各种外科并发症[12]均会引起肝移植术后LS升高。然而本实验研究提示，肝移植术后早期LS升高应当谨慎诠释。由于目前尸体供肝肝移植均采用冷保存，其移植过程中不可避免地会出现胆管上皮损伤[2]，因此移植后的胆管必然出现代偿性增生，LS升高属于正常现象，此时LS升高未必与胆汁淤积、肝脏充血或肝纤维化有关。Lee等[15]也观察到肝移植术后早期非病理情况下的LS升高，推测此时LS升高可能提示移植肝较好的胆管增生能力。另外，基于移植肝供肝冷保存过程中广泛存在的胆管损伤[2]，Karimian等[1]提出胆管增生不足是肝移植术后发生胆道并发症的关键，故肝移植术后超声弹性的测定很有可能在预测胆道并发症的发生方面有一定的价值。因此，肝移植术后早期LS升高时应当动态监测，并且结合多种检测指标综合评估，以免导致过度医疗，同时有望为评估肝移植术后胆道并发症的发生提供一定的信息。

图3 实验组术后2周、4周时LS与胆管增生数量的相关性

本研究应用剪切波弹性成像初步探讨了大鼠肝移植术后LS在评估胆管增生能力方面的应用价值，但因肝脏炎症细胞浸润会明显影响LS[16]，故本研究未对1周时的LS进行分析，因此炎症较重时的LS与胆管增生数量的相关性仍需进一步研究。另外，LS用于临床评估胆管增生能力以及判断何种程度的胆管增生足以代偿移植过程中的胆管损伤尚需进一步研究。

总之，肝移植术后LS的改变与胆管增生数量显著相关，LS在胆管增生评估方面具有一定的应用价值，其临床应用价值需进一步探讨。

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（责任编辑 张春辉）

Experimental Study of Supersonic Shear Wave Elastography in Assessing Biliary Proliferation After Liver Transplantation Under Cold Preservation

PurposeTo explore the value of supersonic shear wave elastography in assessing biliary regeneration of liver transplantation under cold preservation by using biliary duct injury model.Materials and MethodsNinety-six SD rats were randomly equally divided into experimental group and control group, each including 24 donors and 24 recipients. The donor livers in the experimental group were stored at 4℃ for 12 hours and then performed the transplantation; while those in the control group were performed the transplantation in the conventional way. The animals in each group were further randomly divided into three subgroups, and underwent supersonic shear wave elastography at 1 week, 2 weeks and 4 weeks after operations. The liver specimens were examined pathologically. The liver stiffness index and average number of bile ductules in the portal area were compared among the subgroups.ResultsThe liver stiffness index in the experimental group was signifcantly higher than that in the control group at 1 week, 2 weeks and 4 weeks after operation (F=89.98, P＜0.01). In the experimental group, the differences were signifcant either between 1 week and 2 weeks or between 2 weeks and 4 weeks (P＜0.05). Moreover, the liver stiffness index was positively correlated with the number of biliary proliferation in the subgroups of experimental group at 2 weeks and 4 weeks after operation (r=0.898, P＜0.01).ConclusionThe change of liver stiffness is signifcantly correlated with the number of biliary proliferation after liver transplantation, which shows that shear wave elastography is valuable in the assessment of biliary proliferation.

Liver transplantation; Ultrasonography; Elasticity imaging techniques; Cryopreservation; Bile ducts, intrahepatic; Hyperplasia; Rats

1.解放军总医院超声科 北京 100853

2.解放军总医院肝胆外科 北京 100853

罗渝昆

Department of Diagnostic Ultrasound, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Address Correspondence to: LUO Yukun

E-mail: lyk301@163.com

国家自然科学基金项目（81271588）。

R-33；R445.1

2014-01-09

修回日期：2014-04-21

中国医学影像学杂志

2014年 第22卷 第5期：321-324

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(5): 321-324

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.05.001