不同豆浆制备工艺活性成分与DPPH自由基清除能力比较研究

于寒松，张 伟，陈今朝，胡耀辉,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.国家大豆产业技术研发中心加工研究室，吉林 长春 130118）

不同豆浆制备工艺活性成分与DPPH自由基清除能力比较研究

于寒松1,2，张 伟1，陈今朝1，胡耀辉1,2,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.国家大豆产业技术研发中心加工研究室，吉林 长春 130118）

以7个品种的大豆为原料，分别以生浆工艺和熟浆工艺制备豆浆，通过福林-酚法、亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法、反相高效液相色谱和DPPH法对各个样品中的总酚含量、总黄酮含量、异黄酮和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力性进行测定。结果表明：原料、熟浆工艺豆浆与生浆工艺豆浆总酚和总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力均具有显著性差异（P＜0.05），熟浆工艺豆浆的总黄酮、总酚和DPPH自由基清除能力均高于生浆工艺豆浆，异黄酮含量差异不显著（P＞0.05）。

大豆；生浆工艺；熟浆工艺；活性成分；DPPH自由基清除能力

大豆能提供丰富的主要营养元素和微量营养元素，除了自身的营养价值外，大豆还被长期认定为能够促进肌体健康的功能性食品，同时具有治疗能力[1]。大豆还具有降低血糖指数[2]和预防乳腺癌[3]作用，对治疗心血管疾病和促进骨骼健康也有很好的疗效[4]。近期实验研究证明，大豆具有明显的抗氧化活性[5-7]。这些结果表明，大豆作为一种优良食物，在预防疾病和天然抗氧化剂方面都是很好的来源。在各种大豆制品中，豆浆的蛋白质消化率最高（约为95%），可被人体充分利用，且豆浆不含乳糖，不会产生“乳糖不耐症”等过敏问题，豆浆还不含胆固醇和淀粉，适用于患心脑血管疾病的患者和糖尿病以及肥胖症患者饮用[8]，是老少皆宜的营养食品。

Toda等[8]详细分析了生浆、熟浆工艺豆浆中蛋白、脂肪含量及豆乳黏度等差异，李景妍等[9]分析了生熟浆豆浆的香气差异。豆浆作为一种健康饮品，对其活性成分含量和DPPH自由基清除能力研究却未见报道，对不同制浆工艺即加工工艺对活性成分的影响更是没有系统的研究。因此，本实验采用7 种不同的大豆品种分别采用熟浆和生浆制备豆浆，对所有样品进行总酚、总黄酮、异黄酮以及DPPH自由基清除能力检测分析，并进行比较研究，分析这两种工艺存在的优缺点。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

大豆品种五星4号、冀豆12、冀豆15、冀豆17、铁丰29、铁丰31和齐黄34由国家大豆产业技术研发中心提供。

大豆异黄酮标品：染料木苷（genistin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、大豆苷（daidzin）、黄豆黄素（glycitein） 成都曼斯特生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Trolox标准品 美国Sigma公司；福林酚 上海荔达生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

InfiniteM200酶标仪 瑞士Tecan公司；LC20A高效液相色谱 日本岛津公司；ALPHA1-2L型冷冻干燥机瑞士布奇公司；GL-20G-Ⅱ离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3方法

1.3.1豆浆制备工艺

将大豆原料进行挑选，除杂，分别称取2 份130 g大豆作为两种制浆工艺，洗净后加5 倍水20 ℃浸泡16 h，清洗沥干添加9 倍大豆质量的水磨浆，所得豆糊根据不同制浆工艺分别采取不同加工方法制备生熟豆浆，制浆工艺流程如下：

生浆工艺生产流程：挑选大豆→浸泡→粗磨浆→精磨浆→过滤→煮沸5 min→豆浆

熟浆工艺生产流程：挑选大豆→浸泡→粗磨浆→精磨浆→带渣煮沸5 min→过滤→豆浆

1.3.2样品预处理

精确称取0.5 g冷冻干燥豆浆粉末，每种样品分别取3 个平行样，置于45 mL离心管中，分别向离心管中添加5 mL酸性丙酮溶液（丙酮与蒸馏水与乙酸体积比为70∶29.5∶0.5），并对离心管进行密封，将离心管放置在恒温培养振荡器上，常温300 r/min振荡3 h，振荡结束后，将样品提取液在黑暗条件下静置12 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液，于4 ℃冰箱中冷藏保存，待测。

1.3.3干物质含量测定

精确称取大豆原料粉末与不同工艺制备豆浆的冻干粉末2.000 0 g（精确至±0.000 1 g），在105 ℃烘干

12 h，得到其干物质含量。

1.3.4总酚含量测定

采用文献[10-11]中的福林酚法并稍作修改，以没食子酸为标品，分别配制20、40、60、80、100、120、140 μg/mL梯度的没食子酸乙醇溶液，以没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到线性回归方程：y=0.043 6x+0.044 7（R2=0.991）。

取50 μL标品或样品，加入3 mL蒸馏水，250 μL福林酚试剂和7%Na2CO3溶液，室温下漩涡混匀，静置2 h，用200 μL微量移液器分别将混合溶液移至96孔板上，用酶标仪于765 nm波长处测定其吸光度。

1.3.5总黄酮含量测定

采用Heimler等[5]的比色法测定。以芦丁为标准品，分别配制 10、20、40、60、80、100、200、300 μg/mL梯度的芦丁乙醇溶液，以芦丁质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到线性回归方程：y=0.006x+0.043（R2=0.999）。

取0.5 mL标品或样品提取液，加95%乙醇1.0 mL，再加入0.25 mL 4% NaNO2溶液 (现用现配)，静置6 min，再分别加入0.25 mL10% Al(NO3)3溶液，静置6 min，最后各加入1.5 mL 4%NaOH溶液，用自封膜封好后通过漩涡混合器完全混匀。分别转移不同样品混合物200 μL至96孔板上，用酶标仪于510 nm波长处测定其吸光度。

1.3.6异黄酮含量的检测

样品处理：精确称取1.00 g冻干样品，加入5 mL乙腈和4.5 mL蒸馏水，室温下静止2 h，6 000 r/min离心20 min，用NO.42滤纸过滤后在35 ℃条件下旋转蒸发得浓缩液，加5 mL 80%甲醇复溶，取20 μL进行高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

HPLC分析条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM-303（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：体积分数0.1%乙酸的水溶液，流动相B：体积分数0.1%乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件如表1所示；流量：1.0 mL/min；柱温：34 ℃；进样量：20 μL；检测波长：262 nm。

表1　高效液相色谱仪的流动相条件Table 1 Mobile phase conditions for HPLC

将5种大豆异黄酮标准品分别配制质量浓度10、20、30、40、50 μg/mL的标准溶液，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标得到不同的异黄酮单体的线性回归方程：大豆苷：y=350 000x+200 000（R2=0.995 4）；染料木苷：y=200 000x+572 60（R2=0.991 6）；大豆苷元：y=750 000x-170 000（R2=0.994 5）；黄豆黄素：y=210 000x+554 99（R2=0.991 9）；染料木素：y=990 000x+589 69（R2=0.992 4）。

1.3.7DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力采用Chen等[12]的方法，取0.2 mL样品或Trolox，加入3.8 mL的0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，用自封膜封口，通过漩涡混合器完全混匀，在室温下静置30 min。静置结束后，分别转移不同样品混合物200 μL至96孔板上，使用酶标仪在517 nm波长处测定吸光度。

分别制备500、250、100、50、20 μmol/L不同浓度梯度的Trolox乙醇溶液。以Trolox浓度为横坐标，清除率为纵坐得到标准曲线：y=2.645 4x+0.113 3（R2=0.999 5）。清除率按照下式计算：

式中：A0为空白式样（95%乙醇）与DPPH溶液混合后所测得的吸光度；Ai为不同浓度梯度Trolox溶液或样品与DPPH溶液混合后所测得的吸光度。

Trolox浓度当量由标准曲线通过样品的清除率计算。1.4 统计学分析

所有实验均重复3 次，进行多组样本间差异显著性分析时P=0.05，皮尔逊相关系数（r）用来评价两个变量的线性相关性，分析均采用SAS 9.3软件，检测分析结果表示为

2　结果与分析

2.1不同样品干物质含量

表2　不同大豆品种原料豆粉及生熟浆粉末的干物质含量Table 2 Dry matter contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties%

2.2不同样品总酚含量比较分析

表3　不同大豆品种原料豆粉及生熟浆冻干粉末总酚含量Table 3 Total phenol contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varietiesmg/g

由表3可知，7 种不同大豆品种的总酚含量差异比较大，变化范围从2.98～5.24 mg/g，冀豆17号总酚含量为齐黄34号的1.8倍；然而不同大豆品种制备的熟浆中总酚含量均高于生浆的总酚含量，且均具有显著差异（P＜0.05），其中铁丰31号，熟生浆的总酚含量差异性最大，其熟浆总酚含量为5.14 μg/mg，生浆总酚含量为3.29 μg/mg，熟浆总酚含量是生浆的1.6倍。熟浆的总酚含量均高于原料的总酚含量，且也具有显著差异（P＜0.05），这与曹展等[13]的研究结果一致，分析可能是多酚的芳香环结构在加热时发生改变而导致溶出率的变化。但是原料与生浆总酚含量相比，除了五星4号外，其他原料品种总酚含量都略高于生浆总酚含量，说明在生浆制浆工艺中，多酚类物质损失比较多。

2.3不同样品总黄酮含量比较分析

表4　不同大豆品种原料豆粉及生熟浆冻干粉末总黄酮含量Table 4 Total flavonoids contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties mg/g

由表4可知，7 种不同大豆品种的总黄酮含量互相差异均显著（P＜0.05），变化范围从24.34～31.71 mg/g；不同大豆品种制备的熟浆中总黄酮含量均高于生浆的总黄酮含量，且均具有显著差异（P＜0.05）。熟浆的总酚含量均高于原料的总黄酮含量，生浆的总酚含量均低于原料的总黄酮含量，且也具有显著差异（P＜0.05），说明熟浆溶解出的黄酮含量要高于生浆。

2.4 不同样品异黄酮含量比较分析

已从大豆中分离出12 种异黄酮类化合物，即9 种异黄酮糖苷和3 种相应的糖苷配基[14]。其中主要成分为大豆苷和染料木苷，占总异黄酮量的98%左右。本实验主要考察不同样品中染料木苷和大豆苷的含量及其对DPPH自由基清除能力的影响。

表5　不同大豆品种原料豆粉及生熟浆冻干粉末大豆异黄酮含量Table 5 Isoflavone contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varietiesmg/g

由表5可知，不同的大豆原料异黄酮含量差别较大，变化范围从1.93～4.41 mg/g，冀豆17号的异黄酮含量是铁丰31号的2.3 倍；但冀豆15号、铁丰31号和齐黄34号的染料木苷含量差异不显著（P＞0.05），所有的大豆品种不同豆浆制备工艺的大豆苷含量差异不显著（P＞0.05），染料木苷含量只有冀豆12号生浆和熟浆差异显著（P＜0.05）。因此，熟浆工艺和生浆工艺对豆浆中的异黄酮含量影响不大。

表6　不同大豆品种原料豆粉及生熟浆冻干粉末DPPH自由基清除能力Table 6 Free radical-scavenging capacity of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties μmol Trolox /L

由表6可知，熟浆工艺与生浆工艺相比较，不同大豆品种制备的熟浆的抗氧化能力均强于生浆的抗氧化能力，且均具有显著性差异（P＜0.05）。而除了齐黄34号，不同大豆品种制备的生浆DPPH自由基清除能力均低于大豆原料的DPPH自由基清除能力。

表7　同大豆品种原料豆粉及生熟浆冻干粉末DPPH自由基清除能力与活性成分的相关性分析Table 7 Correlation analysis between DPPH radical-scavenging capacity and three active components

由表7可知，原料总酚含量与其DPPH自由基清除能力具有明显的线性正相关性（r=0.90），熟浆的异黄酮含量与熟浆DPPH自由基清除能力具有线性正相关性（r=0.88），而生浆的异黄酮含量与其DPPH自由基清除能力没有线性相关性（r=-0.15），熟浆的总酚含量与其DPPH自由基清除能力也没有线性相关性（r=-0.06）。

3　结 论

通过对7个不同品种大豆以及不同制浆工艺生产得到的大豆原料和豆浆样品进行分析，得到了不同样品的总酚含量、总黄酮含量、异黄酮含量的数据，发现熟浆工艺的总酚含量和总黄酮含量都高于原料和生浆工艺相应成分的含量，而异黄酮含量在原料、生浆和熟浆工艺中差异均不显著（P＞0.05），实验结果表明熟浆工艺在总酚和总黄酮活性成分的溶出和保留方面要明显优于生浆工艺。

进一步对不同品种大豆原料和豆浆样品的DPPH自由基清除能力分析研究表明，原料总酚含量与其DPPH自由基清除能力具有明显的线性正相关性，熟浆的异黄酮含量与熟浆DPPH自由基清除能力具有线性正相关性，而生浆的异黄酮含量与其DPPH自由基清除能力没有线性相关性，熟浆的总酚含量与其DPPH自由基清除能力也没有线性相关性。由于黄酮类化合物加热可以分解为活性成分糖苷配基[14]，所以虽然不同品种的熟浆与生浆、原料的异黄酮含量没有显著性差异，但是不同品种的熟浆、生浆和原料的异黄酮含量却与DPPH自由基清除能力相关性差异较大（r=0.37、r=-0.15和r=0.88），由此推断可能是总酚和黄酮类化合物中的活性成分糖苷配基与DPPH自由基清除能力的相关性更高，该推论有待进一步研究。

参考文献：

[1] GEIL P B, ANDERSON J W. Nutrition and health implications of dry beans: a review[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1994, 13(6): 549-558.

[2] FOSTER-POWELL K, MILLER J B. International tables of glycemic index[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1995, 62(4): S871-S890.

[3] ADEBAMOWO C A, CHO E Y, SAMPSON L, et al. Dietary flavonols and flavonol-rich foods intake and the risk of breast cancer[J]. International Journal of Cancer, 2005, 114(4): 628-633.

[4] ALEKEL L D, GERMAIN A S, PETERSON C T, et al. Isoflavone rich soy protein isolate attenuates bone loss in the lumbar spine of perimenopausal women[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 72(3): 844-852.

[5] HEIMLER D, VIGNOLINI P, DINI M G, et al. Rapid tests to assess the antioxidant activity of Phaseolus vulgaris L. dry beans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(8): 3053-3056.

[6] MADHUJITH T, SHAHIDI F. Antioxidant potential of pea beans (Phaseolus vulgaris L.) [J]. Journal of Food Science, 2005, 70(1): S85-S90.

[7] TAKAHASHI R., OHMORI R, KIYOSE C, et al. Antioxidant activities of black and yellow soybeans against low density lipoprotein oxidation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(11): 4578-4582.

[8] TODA K, CHIBA K, ONO T. Effect of components extracted from okara on the physicochemical properties of soymilk and tofu texture[J]. Journal of Food Science, 2007, 72(2): 108-113.

[9] 李景妍, 郭顺堂, 陈洋. 生浆法和熟浆法加工对豆浆香气及相应豆腐产品特征的差异[J]. 大豆科技, 2012(2): 36-42.

[10] XU B J, CHANG S K C. A comparative study on phenolic profiles and antioxidant activities of legumes as affected by extraction solvents[J]. Journal of Food Science, 2007, 72(2): S159-S166.

[11] SINGLETON V L, ROSSI J A. Colorimetry of total phenolic with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal of Enology and Viticulture,1965, 16(3): 144-158.

[12] CHEN C W, HO C T. Antioxidant properties of polyphenols extracted from green and black teas[J]. Journal of Food Lipids, 1995, 2(1): 35-46.

[13] 曹展, 范志红, 王璐. 家庭制豆浆中抗营养因子含量变化分析[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 63-68.

[14] 王春娥, 刘叔义. 大豆异黄酮的成分、含量及特性[J]. 食品科学, 1998, 19(4): 39-43.

Comparisons of Chemical Components and DPPH Free Radical-Scavenging Capacity of Soymilk from Different Preparation Methods

YU Han-song1,2, ZHANG Wei1, CHEN Jin-zhao1, HU Yao-hui1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Division of Soybean Processing, Soybean Research & Development Center, China Agriculture Research System, Changchun 130118, China)

Soymilk was prepared from seven varieties of soybeans by two different methods, namely filtrating soybean homogenate before boiling (method 1) and filtrating after boiling raw soymilk with okara (method 2). The total phenols, total flavonoids, isoflavones and free radical-scavenging capacity were determined by Folin-Ciocalteu colorimetry, NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetry, reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH) free radical scavenging assay, respectively. The results showed that the contents of total phenol and total flavonoids and free radical-scavenging capacity were significantly different among raw soymilk and cooked soymilk from both methods (P ＜ 0.05). The second method resulted in higher levels of total flavoniods and total phenols and stronger DPPH free radical scavenging capacity in soymilk than the first method, but without a significant difference in isoflavone content (P ＞ 0.05).

soybean; filtration of soybean homogenate before boiling; filtration after boiling; active components; DPPH free radical-scavenging capacity

TS214.2

A

1002-6630（2014）15-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201415013

2013-07-20

国家现代农业（大豆）产业技术体系建设专项（CARS-04）

于寒松（1979—），男，副教授，博士，研究方向为豆制品加工。E-mail：yuhansong@jluhp.edu.cn

*通信作者：胡耀辉（1951—），男，教授，学士，研究方向为食品生物制造与新资源利用。E-mail：huyaohui@vip.163.com