澄黄滨珊瑚、大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚性腺发育与繁殖力的研究*

申玉春 杨小东 刘 丽 李泽鹏

(广东海洋大学水产学院 南海水产经济动物增养殖广东普通高校重点实验室 湛江 524025)

珊瑚礁是海洋生态系统的重要组成部分,在海洋生物资源增殖、海洋环境保护、海洋减灾和降低大气温室效应等方面,均发挥着重要作用(杨小东等,2014)。然而,长期以来由于人们对珊瑚的生物特性和生态价值认识不足,公众保护意识淡薄,珊瑚礁面临严重的生态危机。因此,研究珊瑚的繁殖生物学特性,对退化珊瑚礁生态系统恢复和重建有重要的指导意义。关于珊瑚繁殖生物学的研究,国内外学者研究较少。Harrison等(1984)在大堡礁观察到32种石珊瑚在春末满月后短时间内发生大规模同步排卵现象,具有多种繁殖类型,并描述了珊瑚幼虫迁移扩散和附着变态的特征。李元超等(2009)研究了三亚鹿回头佳丽鹿角珊瑚卵母细胞发育的组织学,并指出其排卵时间为4月底5月初。黄洁英等(2011)对三亚鹿回头膨胀蔷薇珊瑚和壮实鹿角珊瑚的胚胎和幼虫发育进行了观察。而对于徐闻珊瑚礁保护区珊瑚性腺发育规律和繁殖力的研究未见报道。本文以徐闻澄黄滨珊瑚、大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚为研究对象,观察其性腺发育周期,确定其有性繁殖类型,丰富造礁石珊瑚繁殖生物学理论,为退化珊瑚礁生态系统恢复和重建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 珊瑚样品采集

2011年7月至2012年7月间,每月在徐闻珊瑚礁国家级自然保护区灯楼角海域(109°55′21″E、20°17′1″N)采集澄黄滨珊瑚(Porites lutea)、大管孔珊瑚(Goniopora djiboutiensis)和丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)样品进行组织学观察。在珊瑚性腺发育较快的2012年3—6月连续采样观察,具体方法是在低潮期收集一定数量的以上三种珊瑚集中置于 16m2范围的水域点作为连续采样观察固定对象。观察期间共采集3种珊瑚72株,其中澄黄滨珊瑚32株、大管孔珊瑚24株、丛生盔形珊瑚16株。

1.2 实验观察方法

1.2.1 珊瑚性腺发育的组织学观察 采集的珊瑚样品固定于 10%的海水甲醛溶液中,运回实验室。取部分样品用 10%甲酸和 5%甲醛混合液进行脱钙 2—3d(Harriottet al,1983),剩余样品用 70%酒精保存备用。将脱钙处理过的珊瑚样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、58°C石蜡包埋,连续横向和纵向切片,厚度8µm,H.E.染色(hematoxylin-eosin staining),凝胶树脂封片,在Leica DM6000 B自动生物显微镜下观察、拍照。每个样品包埋4个以上保证纵横切片成功率。

在显微镜下统计单个珊瑚螅体上生殖腺数及单个生殖腺配子数,测量配子直径大小。根据珊瑚生殖腺发育程度及配子发育变化规律,对三种珊瑚配子发育过程进行时相划分。

1.2.2 珊瑚繁殖力计算 采用珊瑚第Ⅳ时相成熟卵母细胞直径(取纵横切片中8个配子的平均值)、螅体生殖腺数、生殖腺卵母细胞数、单位面积螅体数量、单位面积螅体内卵母细胞数量等五个指标衡量珊瑚的繁殖力。

1.2.3 珊瑚脂质含量测定 珊瑚样本经10%的海水甲醛溶液处理24h后,放入Bouin’s fixative溶液脱钙,在70°C条件下24h烘干,称重W1。烘干后的珊瑚样品,用2︰1的氯仿、甲醇溶液脱脂24h,再次烘干,称重W2,W1与W2的差值为珊瑚脂质含量(Folchet al,1957)。

1.2.4 数据分析 采用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行单因素方差分析和 Duncan多重比较,以α=0.05和α=0.01作为差异显著水平,描述性统计值采用平均值±标准误差(Mean±S.D)表示。

2 结果与分析

2.1 珊瑚体内部结构特征

组织切片观察发现,澄黄滨珊瑚和大管孔珊瑚的繁殖方式均为雌雄异体、排出配子体外受精类型,生殖腺结构相似且位于肠系膜上,隔膜将肠系膜分为 12份。澄黄滨珊瑚每个肠系膜有 1个生殖腺,每个螅体上有12个生殖腺(图1e);大管孔珊瑚除个别肠系膜有2个生殖腺外,多数均为1个生殖腺(图2f)。丛生盔形珊瑚为雌雄同体、排出配子体外受精类型,每个肠系膜上有2个生殖腺,生殖腺之间由隔膜隔开(图3c)。

2.2 珊瑚配子发育周期

参照Goffredo等(2004)标准,对澄黄滨珊瑚、大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚配子发育进行分期,各发育时期的基本特征如下。

2.2.1 澄黄滨珊瑚 卵母细胞,第Ⅰ时相,2011年12月初,卵母细胞开始在部分生殖腺内零星出现,中心有一个圆球形的核,卵母细胞直径在 19—31µm,平均25.7µm(图1a,图1b)。第Ⅱ时相,2012年2月底,螅体每个生殖腺内都有 3—5个卵母细胞,核和核仁较明显,细胞质染色加深。卵母细胞形状不规则、大小不一致,直径在 44—61µm,平均 51.7µm(图1c,图1d)。第Ⅲ时相,4月初,卵母细胞体积快速增大,逐渐发育为圆形。卵母细胞始终位于肠系膜中且被中胶层包围,直径在 140—165µm,平均 156.6µm(图1e)。第Ⅳ时相,5月初,卵母细胞间相互粘连,占据整个肠系膜且与膜紧密相连,卵母细胞发育成熟,直径在 190—235µm,平均 223.3µm,此时如果环境条件适宜,就会释放卵母细胞至外界(图1f)。

精巢发育始于 2月中下旬,中胶层开始包围精巢,但尚未完全形成壁,直径变化在 21—28µm,平均24.3µm(图1g);精巢经过2—3个月的发育,5月初发育成熟,中胶层完全包围精巢,精巢中少量成熟的且大的精母细胞位于精巢外围边沿,反之在中央,形成中间裂缝,精巢直径在 85—102 µm,平均 92.6µm(图1h)。

2.2.2 大管孔珊瑚 卵母细胞,第Ⅰ时相,2011年9月中旬,卵母细胞开始发育,位于肠系膜上,直径在33—51µm,平均42.8µm。卵母细胞中心有一个圆球形的核,核质比例较高,细胞质同一性也较高(图2a)。第Ⅱ时相,11月中旬,进入肠系膜的中胶层开始包围卵母细胞,生殖腺内卵母细胞数量增加,形状为椭圆形,直径在 85—121µm,平均 105.9µm(图2b)。第Ⅲ时相,2012年3月初,卵母细胞始终位于肠系膜且被中胶层包围,体积快速增大,直径在 250—325µm,平均296.9µm,卵黄不断积累,核质比减小,细胞核产生极性开始向细胞质边沿迁移(图2c,图2d)。第Ⅳ时相,5月中旬,卵母细胞体积进一步增大,发育成熟,直径在 435—510µm,平均 460.6µm,卵母细胞间完全隔开(图2e,图2f)。

图1 澄黄滨珊瑚配子发育周期显微结构Fig.1 Photomicrographs of Porites lutea showing gametogenesis cycle

3月初第一次采集到生殖腺得到发育的雄性珊瑚,此时精巢已经发育成形,直径在 80—120µm,平均 97.5µm(图2g)。精巢进一步发育,精巢数量增多,形状多为椭圆形和长条形,发育成熟程度趋于一致。5月底,精巢中少量成熟的且大的精母细胞位于精巢外围边沿,反之在中央,形成中间裂缝,发育成熟,直径在 185—215µm,平均 199.4µm(图2h)。

2.2.3 丛生盔形珊瑚 卵母细胞,第Ⅰ时相,2011年9月中旬,生殖腺内卵母细胞开始发育,呈椭圆形,中央出现核和核仁。卵母细胞间发育程度不同,大小不一,刚开始发育的卵母细胞细胞质颜色较深,直径在 37—64µm,平均 50.5µm(图3a)。第Ⅱ时相,11月中旬,卵母细胞细胞质有所增长,卵母细胞数量明显增多,直径在 87—123µm,平均 106.6µm。第Ⅲ时相,2012年4月初,卵母细胞形状趋于一致,排列整齐,占据整个生殖腺,直径在 290—360µm,平均 321.6µm.细胞核逐渐向边沿迁移,并且随着卵黄的不断积累,核质比例减小(图3c,图3d)。第Ⅳ时相,6月中旬,卵母细胞继续增大,直径在 410—510µm,平均 462.5µm。细胞核移至细胞质边沿,紧紧粘附于细胞膜,使膜缩进或凹进,核质比例减小到最低,卵母细胞开始发育成熟(图3e,图3f)。7月中旬,珊瑚排卵后性腺萎缩,中胶层伸展或扭曲,胃皮层和肠系膜膨胀稀松(图3g);2011年11月中旬,将处于第Ⅱ时相的丛生盔形珊瑚从海域转运至实验室生态缸养殖为期 1个月后,卵母细胞细胞质浓缩,体积变小(图3h)。

11月中旬,精母细胞开始发育(图3b),6月中旬,卵母细胞发育成熟时精巢仍未发育成熟,形状呈圆形,处于卵母细胞另一端纵向排列(图3e,图3f)。

图2 大管孔珊瑚配子发育周期显微结构Fig.2 Photomicrographs of Goniopora djiboutiensis showing gametogenesis cycle

2.3 珊瑚性腺发育与排卵时间

澄黄滨珊瑚卵巢开始发育时间较迟,卵母细胞在2011年11月底12月初开始发育,经 5—6个月发育成熟。精巢发育较卵巢滞后但发育速度较快,精巢在 2012年 2月中下旬开始发育,经3—4个月发育成熟。生殖腺发育初期,螅体内生殖腺发育不同步,但临近排卵季节,发育速度加快,最终发育成熟度趋于一致。同一株珊瑚上螅体间生殖腺发育较同步,但在不同珊瑚个体间螅体内生殖腺发育并不同步,甚至在排卵季节,个体间生殖腺内配子尺寸差别较大,卵母细胞直径在 290—325µm,精巢直径变化在 85—102µm。2012年对同一株澄黄滨珊瑚在大潮期间隔取样切片观察发现,5月11日样品成熟配子数量明显少于4月25日,6月9日仍观察到有成熟配子遗留在螅体内,但另有一株雌性珊瑚在7月10日仍未发生排卵。

大管孔珊瑚卵巢开始发育时间较早,卵母细胞在2011年9月中旬开始发育,经 8—9个月发育成熟。精巢发育较卵巢滞后,在2012年3月初已经开始发育,至5月底发育成熟。生殖腺发育后期卵巢形状多为卵圆形,精巢形状多样、大小不一。发育初期个体间生殖腺发育不一致,部分个体生殖腺未开始发育。发育后期,随着发育速度加快,发育成熟度逐渐趋于一致(图2f)。2012年对标记的大管孔珊瑚在大潮期间隔取样切片观察发现,5月28日和30日观察五株大管孔珊瑚成熟配子数量明显少于5月14日,另有一株直径较小的雌性珊瑚在7月10日仍未发生排卵,可能与取样引起的损伤过于严重有关。

图3 丛生盔形珊瑚配子发育周期显微结构Fig.3 Photomicrographs of Galaxea fascicularis showing gametogenesis cycle

丛生盔形珊瑚卵母细胞发育始于8月中旬至9月中上旬,经9—10个月发育成熟。精巢发育始于 11月,较卵巢迟 2—3个月,但发育成熟时间较卵巢迟。卵巢和精巢在肠系膜上独立间隔分布。采集的16株丛生盔形珊瑚螅体内都有卵巢发育,生殖腺发育初期,卵巢内卵母细胞发育程度不同步,大小不同,新发育的卵母细胞,细胞质较深。进一步发育,肠系膜出现两个明显由隔膜分隔开的生殖腺,卵母细胞发育也逐渐趋于同步。发育成熟的卵母细胞在组织纵切图中形状大多为方形,颜色呈现橘黄色,整齐排列于生殖腺内,占据整个肠系膜(图3d),但此时精巢并未发育成熟(图3e),说明丛生盔形珊瑚释放配子至外界进行体外受精且避免自体受精。2012年对标记的丛生盔形珊瑚在大潮期间隔取样切片观察发现,6月19日两株珊瑚成熟卵母细胞数目明显少于6月5日,表明这期间丛生盔形珊瑚可能发生了部分排卵。另有一株珊瑚在7月10日仍未发生排卵。

2.4 珊瑚螅体内脂质含量

对澄黄滨珊瑚、大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚生殖腺螅体内脂质含量测定结果(表1)表明,随着珊瑚生殖腺的发育成熟,三种珊瑚螅体内脂质含量均呈现逐渐升高的变化趋势,到排卵前达到最大值,分别为 12.5%、16.4%和 5.9%。三种珊瑚螅体内脂质含量比较差异显著(P<0.05),其中大管孔珊瑚含量最高,平均值为 13.2%,丛生盔形珊瑚含量最低,平均值为4.2%。

2.5 珊瑚繁殖力

大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚与澄黄滨珊瑚比较,成熟卵母细胞直径较大、单个螅体内成熟生殖腺和单个生殖腺卵母细胞数量均较多,而单位面积内螅体数量较少(表2)。澄黄滨珊瑚成熟卵母细胞直径较小、单个螅体内成熟生殖腺和单个生殖腺卵母细胞数量较少,而单位面积内螅体数量较多,弥补了单位螅体内卵母细胞数量的不足。计算澄黄滨珊瑚、大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚单位面积螅体内所含的卵母细胞数量分别为2184、2016和2280个,统计分析结果显示差异不显著(P＞0.05)。

表1 三种珊瑚螅体内脂质含量变化(M±SD,%)Tab.1 Seasonal changes in lipid content for three coral species

表2 三种珊瑚的繁殖力Tab.2 Fecundity of three coral species

3 讨论

3.1 珊瑚的繁殖方式

石珊瑚目珊瑚具有四种繁殖类型,分别是排出幼虫的雌雄同体型、排出幼虫的雌雄异体型(Kojiset al,1981b)、排出配子体外受精的雌雄同体型(Wilsonet al,2003)、排出配子体外受精的雌雄异体型(Fisk,1981)。本文研究的三种珊瑚有两种繁殖模式,澄黄滨珊瑚和大管孔珊瑚属排出配子体外受精的雌雄异体型,丛生盔形珊瑚属排出配子体外受精的雌雄同体型。

澄黄滨珊瑚和大管孔珊瑚在分类上属滨珊瑚科,滨珊瑚科珊瑚繁殖模式有三种,如P.Lutea(澄黄滨珊瑚)、P.Lobata、P.Compressa、P.Evermanni、P.Australensis是雌雄异体的排卵珊瑚(Glynnet al,1994);P.astreoides是雌雄同体的孵卵珊瑚(Chorneskyet al,1987),P.murrayensis是一种雌雄异体的孵卵珊瑚。Heyward(1989)、Kojis等(1981a)和 Babcock等(1986)在大堡礁、关岛等海域观察到澄黄滨珊瑚繁殖类型为排出配子体外受精的雌雄异体型。Willis等(1985)观察大堡礁的大管孔珊瑚为雌雄异体,进行体外受精,枇杷珊瑚科的生盔形珊瑚和稀杯盔形珊瑚为雌雄同体,释放配子进行体外受精。

3.2 配子发育周期与排卵时间

本文研究的三种珊瑚配子均为年发育周期,澄黄滨珊瑚配子发育期为4—6个月,与Heyward(1989)研究结果一致。大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚配子发育期为8—10个月。大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚的配子发育期比澄黄滨珊瑚长。澄黄滨珊瑚和丛生盔形珊瑚精巢发育相对于卵巢发育具有明显的滞后性,这种现象在滨珊瑚科中较为普遍,精巢发育时间比卵巢短2—3个月。

三种珊瑚排卵时间都集中在 5—6月份,澄黄滨珊瑚从5月初持续到月底都发生排卵,大管孔珊瑚排卵发生于5月中旬持续到6月底,丛生盔形珊瑚排卵发生于5月底至6月中旬。但有研究发现,在大堡礁海域澄黄滨珊瑚和大管孔珊瑚排卵都发生在11月份(Fisk,1981;Williset al,1985),丛生盔形珊瑚排卵发生于10—11月份(Williset al,1985)。在冲绳岛和红海海域丛生盔形珊瑚 7—8月份排卵(Heywardet al,1987)。这些研究说明同一种珊瑚在不同海域具有不同的配子发育期和排卵时间。

我们观察发现徐闻海域4月底多种蜂巢珊瑚科珊瑚已经完成排卵,螅体内缺乏成熟配子,但盾形陀螺珊瑚体内配子在 7月10日仍大部分存留,可见徐闻海域珊瑚排卵主要发生于4—7月份。海南鹿回头海域大部分珊瑚集中排卵发生在3月底至4月中旬(黄洁英等,2011)。石珊瑚大规模排卵在西澳大利亚发生在3月份,日本为6—7月份,台湾南部为3—4月份(Twanet al,2006),大堡礁石珊瑚集中排卵时间随地理纬度变化而变化(Andrewet al,2009)。说明不同海域珊瑚集中排卵时间不同,石珊瑚排卵活动是对栖息海域环境条件的一种适应(Andrewet al,2009)。

Babcock等(1986)提出排卵同步性是多种类珊瑚各自对于环境因子变化(包括海水表面温度、月光和潮汐周期及光周期)的反应。Coma等(1995)提出排卵同步性是外部刺激因素调控内部生物钟的结果。这可能是珊瑚具有类似脊椎动物的内分泌(endogenous)调节因子来调节珊瑚配子发育和排卵的原因(Twanet al,2003)。有研究发现多种类固醇存在于珊瑚体内作为调节因子,如雌二醇(E2)首次发现于大规模排卵的卵子及周围海水中(Atkinsonet al,1992)。在高纬度地区海域,配子成熟和排卵时期,作为外部刺激因素的海水表面温度、光照强度等环境条件具有多变特性,这就可以解释徐闻珊瑚礁珊瑚排卵时间不同的原因。

3.3 珊瑚的繁殖力

组织切片观察表明,澄黄滨珊瑚第Ⅳ时相卵母细胞平均直径为223.3µm,比Harriott等(1983)报道的180µm 大,这是由于测量的卵母细胞处于不同发育阶段引起的。大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚螅体直径较大(>3mm),相应的螅体内卵母细胞尺寸和数量也大,而澄黄滨珊瑚螅体较小(约1mm),卵母细胞直径和数量相对较小。这符合Harriott等(1983)提出的假说:每个螅体中卵母细胞数量和直径随着珊瑚螅体尺寸的增大而增加。澄黄滨珊瑚螅体小,单位面积螅体数量较高,补充了单位螅体内卵母细胞数量的限制。

3.4 珊瑚脂质含量

本研究发现伴随配子的发育成熟,三种珊瑚螅体内脂质含量所占比例呈现上升趋势。尤其是卵母细胞发育后期脂质得到大量积累。石珊瑚体内贮存有大量的脂质,占组织干重的 14%—37%,这些贮存的脂质由虫黄藻合成并转移到珊瑚虫组织中(Harlandet al,1993)。这种脂质积累现象可能是珊瑚体对于能量的一种贮备,有利于提高排卵后受精成功率、其后胚胎的发育及排卵后珊瑚体自身恢复正常生长状态。

4 结论

在中国徐闻珊瑚礁保护区海域,澄黄滨珊瑚为排出配子体外受精的雌雄异体型,卵母细胞发育始于11月底12月初,经5—6个月发育成熟;排卵从5月初持续到月底;螅体内成熟的卵子平均大小为223.3µm;单位面积螅体内所含的卵母细胞数量为2184;排卵前螅体内脂质含量为12.5%。大管孔珊瑚为排出配子体外受精的雌雄异体型,卵母细胞发育始于9月中旬,经8—9个月发育成熟;排卵从5月中旬持续到 6月底;螅体内成熟的卵子平均大小为460.6µm;单位面积螅体内所含的卵母细胞数量为2016;排卵前螅体内脂质含量为16.4%。丛生盔形珊瑚为排出配子体外受精的雌雄同体型,卵母细胞发育始于 8月中旬至 9月初,经9—10个月发育成熟;排卵从5月底持续到6月中旬;螅体内成熟的卵子平均大小为462.5µm;单位面积螅体内所含的卵母细胞数量为2280个;排卵前螅体内脂质含量为5.9%。三种珊瑚生殖腺螅体内脂质含量随着生殖腺的发育成熟而逐渐升高,大管孔珊瑚和丛生盔形珊瑚与澄黄滨珊瑚比较,成熟卵母细胞直径较大、单个螅体内成熟生殖腺和单个生殖腺卵母细胞数量均较多,而单位面积内螅体数量较少。

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