重金属胁迫下厚壳贻贝谷胱甘肽S-转移酶基因表达分析*

刘慧慧 何建瑜 赵荣涛 薛超波

(1.浙江海洋学院 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 舟山 316004;2.舟山市质量技术监督检测研究院 舟山 316021)

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是一种栖息于海水中的常见双壳经济贝类,北至辽宁大连,南至福建东山均有分布,以浙江沿海资源量最大,其软体部蛋白质含量较高,鲜味氨基酸和必需氨基酸组成丰富,微量元素构成合理,属营养价值和经济价值都较高的海产贝类(何建瑜等,2012),已发展为浙江沿海重要的经济养殖品种。但随着近年来沿海城市工业化进程的加速,厚壳贻贝繁殖的周边海域水质、环境因子持续恶化,生境污染不断加剧,作为一种典型的滤食性潮间带生物,厚壳贻贝因具有个体较大,生活史较长,活动性差,容易采集,对环境污染物(如重金属、病原微生物等)具有很强的耐受性等特征,常被作为环境指示生物来监测海区环境的变化。

谷胱甘肽 S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)是多功能解毒酶超家族中的一员(雷安平等,2009;张妍,2012),主要在抗毒机制第II阶段起作用,因此也称为 II相解毒酶,在生物体内起到抵抗外源物质入侵和细胞毒性防御的作用(Saranya Revathyet al,2012;Umasuthanet al,2012),涉及细胞的去毒及毒素的解毒过程(Masellaet al,2005;Ohnumaet al,2011)。其作用机理是促进还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的活性基团—巯基与毒素结合形成亲电子试剂(程炜轩等,2009),使亲电的疏水化合物变成亲水物质,易于从胆汁或尿液中排泄(Liaoet al,2006)。此外,GST通过催化过氧化氢的氧化还原反应,清除体内由代谢反应产生的氧自由基和过氧化物,参与体内免疫反应(罗凯娅等,2012),保护细胞免受外界胁迫造成的损伤(Blanchetteet al,2002;张永国等,2006)。另有研究证实,GST中pi型能参与细胞的增殖调控,并通过各种基因控制的酶在抗氧化反应中协同作用发挥功能(Salinaset al,1999,Fuet al,2012),可以作为生物受环境污染的指示标记物,其表达水平在一定程度上可以有效地反应生物体受环境毒物的损害程度(Saranya Revathyet al,2012),该特征在硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)(Blanchetteet al,2002)及太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)(Boutetet al,2004)中均有报道。

GST在生命活动过程中有解毒、抗氧化等保护细胞的作用,而且对污染物有敏感反应,常作为生物标志物。厚壳贻贝因对环境污染物具有耐受性,而常被用作污染指示生物来监测海区环境的变化。因此,为研究厚壳贻贝 GST基因在代谢活动中的作用,以及分析该基因在海洋环境污染监测中的指示作用,本文克隆了厚壳贻贝 GST基因,并采用实时荧光定量PCR技术,以其血液中GST为分子标记,监测镉、铜等重金属胁迫下 GST基因的相对表达情况,以期为厚壳贻贝的大规模安全养殖及正确运用其 GST分子作为环境污染预警提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

本次实验成体厚壳贻贝于2012年6月购自舟山水产品市场,平均壳长9.3cm,平均壳高4.6cm,于25°C洁净海水中暂养1周,每天换新鲜海水,定期投喂微绿球藻(Prochloroccus)和小球藻(Chlorella)。随后将厚壳贻贝随机分为2组,每组30只,并立即抽取各组的3只厚壳贻贝血液,提取总 RNA作为对照组,标记为0d。实验采用 CuSO4·5H2O 和 CdCl2·5H2O 两种重金属进行胁迫处理,将两组贻贝分别置于含铜(Cu2+浓度为20μg/L)和镉(Cd2+浓度为200μg/L)的10L 海水中,每天换一半含有相应浓度重金属的海水,定期投喂微绿球藻和小球藻,分别取处理后第5d、10d、15d、20d、30d的厚壳贻贝(每个时间点随机取3只)血液提取总RNA。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

用一次性针筒(5mL)快速从厚壳贻贝闭壳肌抽取血液,立即置于4°C 800r/min离心10min,沉淀用于总 RNA提取,方法按 TaKaRa公司的 Trizol Total RNA提取试剂盒推荐方法进行,获得的总 RNA以1.5%非变性琼脂糖电泳检测,并置于紫外分光光度计(Bio-Rad,USA)下检测其A260/A280值。以TaKaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)对所提取的RNA进行反转录,获得相应cDNA。

1.3 厚壳贻贝GST基因克隆

根据已知海水双壳贝类紫贻贝(Mytilus galloprovincialis,AF527010)、地中海贻贝(Mytilus edulis,AY557404)、硬壳蛤(Mercenaria mercenaria,EU 024655)、河蚬(Corbicula fluminea,AY885667)、美洲帘蛤(Mercenaria mercenaria,EU024655)的GST基因通过Primer 5.0软件在保守区设计兼并引物GST-F和GST-R(表1)。以厚壳贻贝血液 cDNA 为模板,克隆GST 基因。20μL 扩增反应体系:10×PCR Buffer 2μL,Mg2+(25mmol/L)2μL,dNTPs(2.5mmol/L)0.4μL,GST-F(10μmol/L)、GST-R(10μmol/L)各 0.8μL,ddH2O 13μL,Taq酶(5U/μL,TaKaRa)0.4μL,模板 cDNA 0.6μL。PCR扩增条件:95°C预变性4min,94°C变性1min,53°C退火 30s,72°C延伸 45s,循环 35次;最后 72°C 延伸10min。以DL 2000 Marker为标记,1.5 %琼脂糖电泳检测PCR产物,选取与预期大小一致的约500bp的条带用琼脂糖胶纯化试剂盒(TIANGEN)纯化后,送上海英潍捷基生物公司测序。

表1 厚壳贻贝GST基因克隆及荧光定量所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for GST cloning and real- time quantitive PCR in Mytilus coruscus

1.4 厚壳贻贝GST基因克隆序列分析

将双向测序获得的 cDNA序列利用 DNAstar7.0软件进行拼接,以 Clustal X1.8和 BLASTn(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST/)进行序列同源性比对,在MEGA4.1软件中采取Neighbor-Joining算法构建系统发育树,1000次重复计算Bootstrap值(Kumaret al,2004),进行系统发育分析。

1.5 厚壳贻贝GST基因表达实时荧光定量PCR检测

根据GST基因测序结果设计荧光定量PCR引物qGST-F和qGST-R,采用RT-PCR法,以β-actin为内参,分析 Cu2+和Cd2+胁迫下厚壳贻贝血液中 GST的表达情况(引物 qGST-F、qGST-R、β-actin-F、β-actin-R见表1)。20μL PCR 反应体系:qGST-F(10μmol/L)与qGST-R(10μmol/L)各 0.8μL,2×SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)10μL,cDNA 0.8μL,ddH2O 7.6μL,反应在ABI-7500型PCR仪上进行,采用两步法进行扩增,即95°C预变性1min,95°C变性10s,59.6°C延伸45s,共40个循环,结束后,从55°C 缓慢升温到95°C,制备熔解曲线。每次反应都设置阴性对照和无模板对照,每个反应3个重复孔。

1.6 数据处理

GST的相对表达量按用最小二乘法 2-ΔΔCT法计算(Pfaffl,2001),并利用SPSS 13.0进行单因子显著性差异分析(ANOVA)和t检验,分别标记为显著差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。

2 结果

2.1 基因扩增及进化发育分析

以反转录得到的血液cDNA为模板(总RNA浓度,A260/A280=1.91),用兼并性引物扩增得到一条约500bp的特异性条带,与预期扩增产物片段大小接近(图1)。经 3次测序确认后的序列提交 NCBI数据库获得GenBank序列号为 KC176684,通过BLAST比对发现,该序列与紫贻贝(AF527010)和地中海贻贝(AY557404)的 pi型 GST基因均有较高的相似性(93%—94%),初步判断所获得的GST分子为pi型。选取人、猴、鼠、巨蛎及部分双壳贝类各种 GST亚型利用MEGA4.1构建厚壳贻贝GST的系统发育树见图2,结果发现,Alpha、Zeta、Kappa、Pi、Omega、Mu和Sigma等7种亚型的GST基因之间相互成簇,各聚成一支;且每一种亚型中脊椎动物和无脊椎动物的GST基因也相互分开,各聚成不同的亚支,说明各亚型差别明显,具有相对独立的保守结构域。厚壳贻贝GST与pi型GST双壳贝类位于同一进化支,进一步说明本次实验获得的GST基因归属于pi型,这与 BLAST的比对结果相似,同时也说明厚壳贻贝GST与人、猴、鼠等在进化上具有较大的差别。

图1 GST扩增产物电泳图谱Fig.1 The gel electrophoresis pattern of GST PCR product

2.2 Cu2+及Cd2+胁迫下厚壳贻贝GST基因表达

GST和内参β-actin的扩增曲线均呈“S”形,复孔间扩增曲线重叠,指数区明显、基线平整,阴性对照和无模板对照无扩增,熔解曲线均为单一峰,扩增效率达 100%±5%,说明定量 PCR反应体系良好,无非特异性扩增,确保相对定量结果的准确性(周向红等,2011)。检测发现,厚壳贻贝GST受铜胁迫前几天一直处于低水平表达,至第10 d表达迅速达到最高,为对照组的6.95倍,接下来的10 d内一直保持相对较高的表达水平,约为对照组的2.5—3.5倍,之后开始下降,30d后GST表达量基本下降至对照组水平。Cd2+胁迫处理后,GST的表达值一直处于逐步上升状态,15d时达到最高,约为对照组的6.11倍,之后表达逐渐降低,至30 d时仍略高于(1.49倍)对照组。上述结果说明,GST基因参与了重金属的解毒过程,但是对于不同的重金属解毒作用稍有不同。

3 讨论

3.1 厚壳贻贝GST基因的序列分析

目前已发现的谷胱甘肽 S转移酶亚型至少有 14种(Wanet al,2008;Umasuthanet al,2012),分别为alpha(α)、beta(β)、delta(δ)、epsilon(ε)、zeta(ζ)、theta(θ)、kappa(κ)、lambda(λ)、mu(μ)、pi(π)、sigma(σ)、tau(τ)、phi(φ)和omega(Ω)。这些亚型的分类基于对谷胱甘肽S-转移酶基因N端结构域的氨基酸、结构、抗体反应以及对抑制剂的敏感性(Kimet al,2009)。本次实验扩增得到厚壳贻贝GST序列经测序和Blastn比对初步判定为pi型,在系统进化树中与双壳贝类pi型GST位于同一进化支,与人、猴、鼠等进化上差别较大。此外,上述各种GST亚型之间相互成簇,各聚成一支,该结果与周向红等(2011)对条斑紫菜 GST基因的分析类似。有学者(林群等,2009)提出,各种GST基因最终汇聚成同一树根,可能是由于它们在起源上具有相同的祖先,由同一的GST基因发展变化而来。

pi型是众多 GST亚型的典型代表,广泛参与免疫细胞中毒素的代谢和亲脂性化合物及其衍生物的产生过程(Kimet al,2009),因其具有抗氧化活性,并参与机体免疫防御,常被用作环境污染的指示标记物,其表达水平在一定程度上可以有效地反应生物体受环境毒物的损害程度,该特征在海洋双壳贝类中表现明显,已获得的海洋贝类中的 GST基本属于pi型(Yanget al,2004;Rheeet al,2007)。本研究已从厚壳贻贝中克隆出的该条基因核心序列,还有待于通过扩增基因全长确定其结构特征,并找到调控位点,为进一步利用该基因评估厚壳贻贝等海洋经济贝类的养殖水体污染状况奠定基础。

图2 厚壳贻贝GST基因与其他GST亚型之间的进化分析Fig.2 The relationship of M.coruscus GST-pi and other GST in phylogenetic tree

图3 重金属胁迫下厚壳贻贝pi型GST基因的表达分析Fig.3 Expression analysis of GST-pi from M.coruscus under stress of heavy metals

3.2 重金属胁迫下厚壳贻贝GST基因的表达分析

通过相对定量表达分析发现,铜和镉胁迫均能促使厚壳贻贝 GST基因表达升高,且表现为时间依赖型,该结果说明厚壳贻贝对重金属刺激较为敏感,可以通过自身的代谢调控作用排出毒素,GST基因在该免疫过程中发挥了重要作用,参与重金属的解毒过程,周向红等(2011)用不同浓度重金属(铅)刺激条斑紫菜,其 GST表达出现类似的结果。有研究证实,GST参与重金属解毒的过程主要通过两种方式:一是 GST基因能够催化还原型谷胱甘肽直接与重金属离子共价结合,从而降低重金属离子毒性并促进重金属向液泡或质外体转运(Adamiset al,2009);二是GST的过氧化物酶活性能利用还原型谷胱甘肽向氢过氧化物发动亲核攻击,使其还原为低毒的一元醇(monohydroxy alcohol),从而缓解重金属胁迫产生的氧化胁迫(Edwardset al,2000)。

此外,铜和镉胁迫后 GST基因的表达特征略有不同,其中Cu2+刺激10d时表达量达到最高,为对照组6.95倍,Cd2+刺激15d时表达量最高(6.11倍),随后都开始下降,但 Cd2+刺激后的表达量下降较为缓慢,至30d时仍有较高的表达(约为对照组的1.49倍)。上述表达特征可能是由于 GST对不同重金属的解毒能力有所不同。另外,海洋贝类中的 GST虽然主要为pi型,但仍有其他类型GST的存在,生物表现出的解毒作用亦是不同类型GST综合作用的结果,Boutet等(2004)研究太平洋牡蛎受到碳氢化合物和农药的污染后GST的表达水平,发现体内各种亚型的GST表达量都有明显的变化,且与毒素类型以及浓度有关,与环境因子和个性特征无关。本研究还有待于进一步检测不同浓度重金属刺激作用下 GST的表达量,以确定生物的耐受程度,从而利用基因的表达情况指示水环境中重金属的污染状况。

3.3 厚壳贻贝GST分子对环境污染的指示功能

环境污染物是引发经济贝类发生死亡的重要原因,至今已报道的环境污染物有重金属、杀虫剂、有机污染物、工业废水和环境内分泌干扰物等,上述毒物进入细胞后,大量的等活性氧分子立即在细胞中产生,这些活性氧分子不但直接对细胞造成损伤,还将大量脂质分子氧化成为过氧化脂质,细胞膜的结构与功能会受到过氧化脂质的影响,机体正常的生命活动受到危害(梁旭方,2006)。GST分子具有细胞解毒和抗氧化双重功效,当环境污染物对贝类产生刺激时,其机体内的 GST活性显著升高(Blanchetteet al,2002),并通过催化过氧化氢的氧化还原反应,清除体内由代谢反应产生的氧自由基和过氧化物,保护细胞免受外界胁迫环境损伤(张永国等,2006),基于此敏感反应,GST可作为环境污染指示分子(Lenartovaet al,2000),并有研究证实GST活性与污染物水平显著相关,可直观反映环境的污染状况(Martinez-Laraet al,1996)。在环境污染的评估和监测方面,贝类的pi型GST的作用尤为突出(Rheeet al,2007),Blanchette等(2003)对北方圆蛤pi型GST的研究是最早报道的海洋双壳贝类 pi型 GST,结果指出pi型GST具有很强的解毒作用,从而使北方圆蛤能生活在污染严重的水体中,菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的pi型GST亦是镉等污染物的良好指示分子(Wanget al,2011);Feng等(2009)对硬壳蛤pi型GST研究发现,该基因没有内含子,且这种无内含子的GST要比有内含子的GST解毒效果更明显,而高速游动的乌贼、斑马鱼等水生生物GST均有内含子,说明活动性差的贝类 GST解毒效果更强,可成为很好的环境污染指示物。

厚壳贻贝作为典型的营附着生活的双壳贝类,对环境污染具有很强的耐受性,是最常见的指示水体持久性污染的生物指示剂(Hoarauet al,2004)。本研究中,在铜和镉持续胁迫下,厚壳贻贝GST基因的表达呈明显上升状态,说明 GST参与该生物的解毒过程,可以指示水环境中重金属的污染状况。Boutet(2004)曾指出pi型GST是农药污染监测的有效标记物,而重金属是农药中的组成成分,本项研究结果可为重金属污染的防治和检测提供有效手段。因此,通过对厚壳贻贝等贝类体内 GST表达水平进行实时监测,可加强对养殖水体中重金属污染程度的检测,保证水产养殖业的持续健康发展。

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