柔红霉素对HL-60敏感细胞miRNA-21等5种miRNA表达的影响

燕 华，李 卫

（1.河南省郑州市儿童医院血液科 450053；2.广西医科大学科学实验中心，南宁530021）

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓系白血病（AML）的一种特殊类型，染色体异位t（15；17）和（PML／RARa）融合基因阳性是其惟一的形态学特征，约占AML的10%～15%，临床特征易导致弥散性血管内凝血（DIC）[1]。柔红霉素（DNR）可与DNA结合，并抑制核酸的生物合成，是目前治疗AML的主要化疗药物之一。尽管目前通过DNR、维甲酸等治疗已经可以使初治患者的完全缓解率大幅度增加，但仍有部分患者由于病情复发而死亡，其中原因之一就是白血病细胞对化疗药物产生耐药。耐药性的产生是由多种机制作用而产生的，其中主要包括ATP依赖的能量泵活性增强使细胞内药物外排增加、拓扑异构酶Ⅱ表达改变使增加肿瘤细胞DNA损伤的修复能力增强以及肿瘤细胞凋亡减少而产生的耐药性等[2-4]。耐药基因主要包括多药耐药基因（MDR1）、多药耐药相关蛋白基因（MRP）、肺耐药蛋白基因（LRP）、乳腺癌耐药蛋白基因（BCRP）等。目前，随着miRNA研究的不断深入，越来越多的研究发现miRNA与白血病及其耐药方面存在密切的联系。

miRNA是一类长度为19～25个核苷酸，非编码的RNAs，广泛存在于真核生物中，在后转录水平调控mRNA的表达[5]。现已发现，miRNA参与许多生物学过程，例如细胞增殖，分化和凋亡等，人类大约30%的基因受到miRNA的调节[6-7]。近年来，miRNA与胃癌、乳腺癌、卵巢癌等相关的多药耐药miRNA相继报道，在白血病多药耐药方面也引起了越来越多的关注。目前，在其他肿瘤中已经发现miRNA-21、miRNA-125b、miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f等5种 miRNA可能与耐药相关，但关于他们在HL-60细胞中的表达及DNR对他们的影响鲜有报道，因此，本研究采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测这5种miRNA在HL-60中的表达情况，并探讨DNR对这些表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人APL药物敏感细胞HL-60购自武汉博士德公司。人APL耐药细胞HL-60／A购自中国医学科学院血液学研究所，该细胞可在500ng／mL的阿霉素培养液中稳定生长。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基购自Hyclong公司，国产四季青胎牛血清（FBS），浙江海正药业有限公司的盐酸DNR，Small RNA提取试剂购于TaKaRa公司的RNAiso for small RNA。逆转录PCR和RT-PCR试剂盒购自Gene CopoeiaTM公司。噻唑蓝（MTT）美国Sigma公司产品，实验前现配5mg／mL溶液。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 取对数生长期的HL-60和HL-60／A置于RPMI1640培养液中（100mL里含有10mL FBS），于37℃、50mL／L CO2饱和湿度的培养箱中稳定生长。细胞悬浮生长，正常情况2～3d更换1次新鲜培养基。HL-60／A以500 ng／mL的DNR维持耐药表型。

1.3.2 实验分组 分为实验组、对照组1和对照组2。其中实验组以小剂量（10ng／mL）的DNR持续作用于HL-60敏感细胞，并于用药后第1、7、14和28天检测细胞的抑制率及miRNA的表达。对照组1和2分别是HL-60／A耐药细胞和不接受DNR持续作用的HL-60敏感细胞。对照组1要以500 ng／mL的DNR维持其耐药表型。

1.3.3 四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测小剂量DNR持续作用对HL-60细胞的抑制率 用10ng／mL的DNR持续作用于HL-60DNR敏感细胞，然后分别在DNR作用后的第1、3、5、7、10和14天取等量的细胞做MTT实验。按照上述实验方法，调整细胞密度，每孔取200μL接种于96孔培养板中，其中实验组分别加入4、8和16ng／mL的DNR，对照组1加入与实验组最大DNR用量等体积的生理盐水，对照组2只含有培养基无细胞，每组设6个孔培养。培养箱中培养48h后加入MTT 20μL，继续培养4h后2 000r／min离心10min，小心吸去上清液，每孔再分别加入150μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡至MTT完全溶解，用酶标仪测各孔490nm波长的吸光度（A）值，绘制小剂量DNR作用不同时间后对HL-60细胞的抑制率曲线。

1.3.4 microRNA的提取和逆转录 按说明用TaKaRa公司的RNAiso for small RNA试剂盒分别提取各实验组及对照组的miRNA，用紫外分光光度计测A260和A280，计算浓度，并用15g／L的琼脂糖凝胶跑电泳检测miRNA的完整性。采用逆转录试剂盒将miRNA逆转录为cDNA，在25μL逆转录体系中含有5×RT Buffer、miRNA模板300ng、2.5UPoly A Polymerase和RTase Mix 1μL。反应条件为37℃60min，85℃5min。所得的逆转录产物用灭菌水稀释10倍进行下一步PCR实验。

1.3.5 RT-PCR检测miRNA的表达 RT-PCR的下游引物为ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR试剂盒提供的通用引物（Universal adaptor PCR Primer），上游引物用 Primer Premier 5.0软件按照引物设计原则进行设计，并由上海生工合成。miR-181d上游：5′-GCG GGA ACA TTC ATT GTT GT-3′；miR-125b上游：5′-GCT CCC TGA GAC CCT AAC TTG-3′；let-7f上游：5′-GGG GGT GAG GTA GTA GAT TGT AT-3′；miR-27a上游：5′-GGA GGG CTT AGC TGC TTG TGA-3′；内参U6和miRNA-21的上下游引物由ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR试剂盒提供。20μL PCR反应体系中含有2×ALL-in-one Qpcr Mix，PCR Forward Primer（2μmol／L）1.5 μL，Universal Adaptor PCR Primer（2μmol／L）1.5μL，10倍稀释的cDNA模板4.0μL和50×ROX Reference Dyeiv 0.2 μL。PCR反应条件为：95预变性10min。95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸40s，重复40个循环。各样本均重复3孔，以平均CT值（阈值循环数）作为每个样本的CT值。并以U6为内参，采用相对定量2-△△CT法进行miRNA相对定量的比较。样品目的基因的相对表达用2-△△CT方法计算，即Fold change＝2-△△CT＝2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值]。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率 以10ng／mL的DNR持续作用于HL-60细胞，然后于用药后第1、3、5、7、10和14天，再分别以4、8和16ng／mL等3种浓度的DNR做48h的MTT实验，观察DNR对细胞增殖的抑制率，见表1。随着DNR作用时间的延长，各浓度的抑制率逐渐减小，且在加药的第10天左右，逐渐进入1个平台期，表明随着小剂量DNR的持续作用，HL-60敏感细胞可能在用药后的第10天左右逐渐对DNR产生耐药，见图1。

表1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率（±s，%）

表1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率（±s，%）

浓度（ng／mL） 加药第1天 加药第3天 加药第5天 加药第7天 加药第10天 加药第14天4 18.60±1.15 15.40±1.12 9.50±0.97 7.50±1.184.40±0.25 3.20±0.93 8 26.70±3.19 16.60±1.22 13.70±0.85 11.50±1.20 6.90±0.93 7.60±0.75 16 33.80±3.17 27.60±2.58 16.50±2.06 14.90±1.19 9.60±1.00 10.90±1.04

图1 DNR作用miRNA-21表达的RT-PCR检测结果

图2 DNR作用miRNA-125b表达的RT-PCR检测结果

图3 DNR作用miRNA-181d表达RT-PCR检测结果

图4 DNR作用let-7f表达的RT-PCR检测结果

图5 DNR作用miRNA-27a表达的RT-PCR检测结果

2.2 miRNA RT-PCR检测结果 RT-PCR检测结果发现，与对照2组比较，miRNA-21和miRNA-125b在对照1组中的表达显著上调（P＜0.05），实验组细胞则从加药的第7天起表达上调（P＜0.05）；相反，miRNA-181d、miRNA-27a、let-7f在对照1组中的表达下调（P＜0.05），而在实验组细胞中则是在加药后的第7天开始下调（P＜0.05），见图1～5。

3 讨 论

抗癌药物的耐药性因人而异，原因很多，其中miRNA也是一个重要的影响因素之一。miRNA的调控是一个复杂的过程，一种miRNA可以作用于多个靶基因，而一个靶基因也可以受多种miRNA调控。在多种人类癌症中已经发现miRNA-21表达上调。Wang等[8]研究发现，上调miRNA-21在 MCR-7／ADR细胞中的表达可导致PTEN蛋白下调，miRNA-21的模拟物和抑制物明显影响乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。转染了抗miRNA-21寡核苷酸（anti-miRNA-21oligonucleotide，AMO-miRNA-21）的细胞可增加HL-60细胞对Ara-C的敏感性，并证实AMO-miRNA-21的作用可能是通过上调PDCD4来实现[9]。随后在耐DNR的K562白血病耐药细胞中发现miRNA-21明显上调，并通过实验证实miRNA-21可以调节PTEN的表达，影响PI3K／AKt通路，从而起到调节K562细胞对DNR的耐药性[10]。Zhu等[11]通过对比多药耐药细胞和亲本细胞，证实miRNA-125b和miRNA-27a在人类耐药的卵巢癌细胞和子宫颈癌细胞中表达上调。Zhang等[12]发现，miRNA-125b在儿童APL细胞中高表达，并且进一步证实miRNA-125b可以通过调节肿瘤抑制基因Bak1的表达来促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。研究还发现，miRNA-125b在HL-60／DOX、K562／DOX、NB4-R1和 NB4-R2这4种白血病耐药细胞中表达上调。这些研究均表明miRNA-21和miRNA-125b可能与肿瘤的耐药相关。本研究首先使用低浓度DNR药物作用于HL-60敏感细胞，然后于用药后的第1、3、5、7、10和14天用不同浓度的DNR测试细胞的MTT反应，结果发现随着小剂量DNR持续作用时间的延长，DNR对于HL-60细胞增殖的抑制率逐渐减小，并在用药后的第10天左右逐渐进入平台期，提示HL-60敏感细胞可能在小剂量DNR持续作用10d左右开始产生耐药。同时，笔者采用RT-PCR检测DNR不同作用时间HL-60敏感细胞中miRNA-21、miRNA-181d、miRNA-125b、let-7f和miRNA-27a5种miRNA的表达，结果发现HL-60／A耐药细胞中的miRNA-21和miRNA-125b表达明显上调，而敏感细胞的miRNA-21和miRNA-125b表达也在小剂量DNR作用后的第7天起出现显著上调，提示miRNA-21和miRNA-125b的表达上调可能与HL-60对DNR产生耐药性有关。

Eric等[13]利用miRNA微阵列技术发现慢性髓细胞白血病细胞敏感株MYL与耐伊马替尼耐药株MYL-R大约有30种miRNA的表达出现超过2倍以上的差异。其中miRNA181（a～d）家族在耐药细胞株中明显下调。本研究发现，miRNA-181d在HL-60／A耐药细胞中表达下调，而敏感细胞则在用药后的第7天起出现下调，与上述结果一致。Feng等[14]通过实验发现在白血病细胞中miRNA27a和miRNA-331-5p与耐药基因P-gp的表达成负相关，并对K562耐药细胞和HL-60 DOX耐药细胞中分别转染miRNA27a和miRNA-331-5p，发现转染后可以增加耐药细胞对DNR药物的敏感性。Let-7最初发现是参与调节线虫发育时序，Yang等[15]的研究表明，let-7i在耐药的乳腺癌细胞中表达下调，并且减少let-7i的表达量可以明显的增加卵巢癌和乳腺癌细胞对化疗药物的抵抗性。本研究也发现，miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f在 HL-60／A耐药细胞中的表达下调，而HL-60敏感细胞则在持续用药的第7天起表达下调，提示miRNA-181d、let-7f和miRNA27a的表达下调也可能与HL-60细胞对DNR的耐药性也具有一定的相关性。

综上所述，本研究对5种miRNA在HL-60细胞中的表达进行了探索，对这5种miRNA与HL-60细胞耐药性的相关性有了初步的认识。今后还需要通过转染miRNA特异的寡核苷酸模拟物及抑制物等手段，进一步了解这些miRNA的靶基因及其作用机制，为降低APL的耐药性，提高药物化疗效果打下理论基础。

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