动态灌注与静态保存对犬离体肺组织中AQP1表达的影响＊

孙相华，洪文娟，洪志鹏△，祝艳翠，周 菊，王亚丽

（昆明医科大学第一附属医院：1.干部医疗科；2.胸外科；3.ICU；4.感染疾病科，昆明650032）

肺移植是治疗晚期肺实质及肺血管疾病的惟一有效方法，随着外科技术、术后处理、免疫抑制剂的快速发展，肺移植患者存活率有了明显提高[1]。然而仍有15%～20%的肺移植患者在术后早期出现严重的移植肺功能障碍，其主要原因为离体肺保存方式欠佳以及缺血再灌注损伤[2-3]。供肺保存的质量对肺移植的成功与否起着决定作用，不同的保存方式对离体肺组织的结构和功能有着重要的影响。单存肺动脉灌洗后低温保存法是目前应用最广泛的保存方式，该保存方式简单、易操作，但不符合肺循环的生理条件，易导致肺循环栓塞，影响供肺的保存质量和保存时间。随着肺移植技术的发展，对供肺保存的质量和时间要求也越来越高。本研究通过比较体外循环机持续灌注、间断压力灌注、单存低温保存离体肺的水通道蛋白1（AQP1）表达变化，探讨离体肺的损伤机制，阐明模拟肺循环和心脏机械灌注的优越性，为保证安全、有效、较长时间的离体肺保存创造了有利条件。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康成年Mongrel犬30只，犬龄2～3年，雌雄不限，体质量15～18kg（购自昆明医科大学动物实验中心）。实验前禁食12h，禁饮6h。分成3组：体外循环机动态灌注组（体外循环组）、间断压力灌注组（压力灌注组）和静态的单存肺动脉灌注后低温保存组（低温保存组），每组10只。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 手术相关器械、PHILIPS有创动脉压监测仪、TKR-200C小型动物呼吸机、体外循环机、离体肺保存液、AQP1抗体等。

1.2.2 肺组织标本摘取 3%戊巴比妥钠犬前肢静脉注射，出现睫毛反射消失，肌力下降时立即进行四肢固定、气管插管、脱毛处理（取仰卧位，前胸脱毛）；游离股动、静脉并插管，正中开胸，心包内游离上、下腔静脉和主动脉，全身肝素化（500IU／kg），肺动脉接有创动脉监测仪，监测及记录实时肺动脉压，升主动脉插心脏麻痹液灌注管，肺动脉干插入肺灌洗导管，依次阻断上、下腔静脉和升主动脉。灌洗心脏麻痹液，切断下腔静脉，排出心脏麻痹液。心脏停跳后，开始肺灌洗，切除左心耳尖端，排出灌洗液，收集保存。在保持正常机械通气的条件下，完整摘取双肺。心脏停搏前同时从股动脉回收血液，采血瓶预存。摘取双肺后称取湿肺质量，经气管向肺内按潮气量10 mL·kg-1·min-1进行通气，维持呼吸，FiO221%，进行持续体外循环机灌注、间断压力灌注、单存灌注离体肺循环后低温浸泡保存直至实验结束。

肺保存液成分：Na＋138.0mmol／L，K＋6.0mmol／L，Cl-142.0mmol／L，Mg2＋0.8mmol／L，SO22-0.8mmol／L，PO43-0.8mmol／L，Ca2＋0.3mmol／L，HCO3-1.0mmol／L，右旋糖酐40.0g／L，葡萄糖0.9g／L。

离体肺组织标本留取方法：离体肺保存0、60、120、180、240、300、360、420、480min 取 材；组 织 标 本 约 1.5cm×1.0cm×0.5cm备用，每次取材后缝合创面，防止漏气。

1.2.3 HE染色法观察犬离体肺组织形态学改变 肺组织采用10%甲醛溶液固定，95%乙醇常规浓度梯度脱水，二甲苯透明2次，石蜡包埋，常规制备5μm切片，HE染色。

1.2.4 免疫组织化学法检测犬离体肺组织AQP1的表达石蜡切片脱蜡和水化后，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）冲洗3次，对组织抗原进行相应的修复。每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育，PBS冲洗，加一抗，室温下孵育60min，PBS冲洗，加二抗，室温下孵育10min，PBS冲洗加新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB）溶液，显微镜下观察3～5min，自来水冲洗，苏木素复染，分化，自来水冲洗，PBS返蓝，切片经梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封固。结果半定量的判定方法：在每个时间点抽取染色清楚的切片，每张切片于光镜下（×400）随机抽取5个视野，固定窗口面积，计数AQP1，根据AQP1着色深度及阳性细胞数分别记分为0～3分，着色深度以多数AQP1呈色程度为准。如果肺泡周围出现明显黄色或棕黄色及棕褐色颗粒为阳性染色，不着色的为0分，呈黄色时为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。整块切片中阳性染色占所有细胞中的比例小于或者等于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。根据上述两项指标的积分相乘进行半定量分析。

1.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测犬离体肺组织AQP1的表达 组织蛋白抽提，配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶，4%浓缩胶，取蛋白质样品上样电泳，采用硝酸纤维素膜湿转，AQP1多克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗稀释比例分别为1∶500与1∶2 000，将ECL显色试剂滴加到膜上，曝光显影保存。采用相关分析软件分析，以每条蛋白电泳带与β-actin的灰度值比值表示AQP1蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 犬离体肺组织病理改变 通过观察病理HE染色切片，发现体外循环组肺泡组织结构比压力灌注组及低温保存组完整，炎性细胞及渗出液少，肺泡间隔也小。组内对比可见，随着离体时间的延长，肺泡组织结构逐渐塌陷，炎性细胞及渗出物增多，肺泡间隔也逐渐增宽，肺泡腔内可见渗出物。综合比较，在同一时间点，体外循环组的组织结构损伤变化比压力灌注组和低温保存组轻。

2.2 免疫组织化学法检测结果 随着时间推移，各实验组AQP1的表达量呈现下降趋势；在每个时间点上，体外循环组AQP1的表达量高于压力灌注组，压力灌注组又高于低温保存组。体外循环组3～8h各时间点两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在1～2h各时间点，各组间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在3～8h各时间点，各组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；低温保存组3～8h各时间点两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；压力灌注组3～8h各时间点两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；见图1～3，表1。

表1 免疫组织化学检测离体犬肺组织AQP1的表达结果（±s）

表1 免疫组织化学检测离体犬肺组织AQP1的表达结果（±s）

0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h体外循环组 10.40±0.63 10.00±0.73 9.70±0.66 8.20±0.99 7.60±1.57 6.60±1.17 5.70±1.49 4.70±0.95 3.80组别±0.82压力灌注组 10.40±0.63 10.10±0.74 9.80±0.82 7.50±1.47 6.50±1.26 5.40±1.51 4.30±1.31 3.10±0.74 2.10±0.71低温保存组 10.40±0.63 10.10±1.03 9.60±0.67 7.00±1.24 5.70±1.72 4.10±0.99 3.40±0.84 2.40±0.70 1.20±0.42

表2 Western blot检测离体犬肺组织AQP1的表达结果（±s）

表2 Western blot检测离体犬肺组织AQP1的表达结果（±s）

0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h低温保存组 1.11±0.06 1.07±0.04 1.06±0.03 1.06±0.04 0.95±0.05 0.87±0.05 0.80±0.09 0.72±0.05 0.63±0组别.04压力灌注组 1.11±0.06 1.16±0.04 1.10±0.05 1.08±0.04 1.02±0.05 0.93±0.04 0.90±0.05 0.84±0.07 0.73±0.06体外循环组 1.11±0.06 1.12±0.07 1.11±0.05 1.10±0.05 1.06±0.04 0.99±0.05 0.94±0.04 0.89±0.04 0.86±0.07

图1 低温保存组离体犬肺组织AQP1免疫组织化学染色（×400）

图2 压力灌注组离体犬肺组织AQP1免疫组织化学染色（×400）

图3 体外循环组离体犬肺组织AQP1免疫组织化学染色（×400）

图4 各组不同时间点离体肺组织AQP1的表达结果

图5 各时间点下各组离体肺组织AQP1的表达结果

2.3 Western blot检测结果 各种保存方式下，随着保存时间的延长，条带灰度变浅，提示AQP1在离体肺组织中的表达随着时间的延长呈逐渐减少的趋势（图4）。各时间点下，0～3 h的各条带灰度基本均匀一致，但在4～8h条带灰度逐渐变浅（图5）。各实验组内0～3h两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；低温保存组内4～8h在组内各时间点（除5h与6 h外）两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；压力灌注组4～8h在组内各时间点（除3h与4h、5h与6h外）两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；体外循环组4～8h在组内各时间点两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在1～3h各时间点，各组间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在4～8h各时间点，各组间两两比较（除4h和6h压力灌注组与体外循环组外），差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨 论

目前国际公认的离体肺保存时间最好在4h以内，超过4 h，发生移植肺功能障碍的概率明显增加[4]。最常用的保存方式为肺循环灌注后的单存低温保存，既往研究表明，离体肺保存过程中最容易出现细胞损伤，它是一个非常复杂的过程，主要包括炎性细胞因子的产生[5]、氧自由基的释放[6]、微小血管的损伤及其通透性的增加[7]。

水的跨膜转运对维持细胞正常代谢具重要作用。水通道蛋白是一组介导水的跨膜转运的通道蛋白，在肺内，其位于肺泡毛细血管内皮的血液侧，主要负责转运肺间质内的水分[8]。AQP1不仅对各级支气管及肺组织内生理和病理状态下水的吸收和转运有重要调节作用，同时也协同钠通道和Na＋-K＋-ATP酶对胸腔内液体进行转运。在肺泡上皮细胞、气管支气管纤毛细胞质膜的顶端及浆液细胞、黏液细胞的基侧部存在的AQP1可能与肺水肿消除有关[9]。有研究表明，敲除AQP1后肺泡毛细血管水的通透性呈显著下降趋势，表明其具有转运或协同水转运的能力[10-11]。

本研究中，通过比较体外循环机持续灌注、间断压力灌注、单存低温保存这3种离体肺保存方式下，肺组织AQP1表达的变化来研究离体肺保存的最佳方法。本研究结果表明，在每种保存方式下，AQP1在离体肺组织中的表达随着时间的延长呈逐渐降低的趋势，说明随着离体肺保存时间的延长，缺血缺氧等各种因素的影响，导致肺组织水肿越来越重。脱离机体后，肺组织仍然进行着有氧代谢，虽然低温可以有效限制有氧代谢的进程，但随着时间的延长，离体肺的缺血性损伤不可避免，主要表现在肺泡间质水肿，肺泡间隔增宽，影响了离体肺保存的质量，加重了肺移植后再灌注损伤[12]。既往研究证实，随缺血缺氧时间延长，肺血管内皮细胞结构损伤越重，血管的通透性增大，合成和释放多种细胞生长因子，导致水分及细胞毒性成分进入肺泡间质，使得呼吸膜厚度增加，水通透性明显降低[13]。

同时在3种保存方式间比较研究发现，体外循环灌注组离体肺组织中AQP1的表达明显高于压力灌注组，压力灌注组又高于低温保存组，表明体外循环机械灌注对离体肺的保护作用明显优于间断压力灌注和单存低温保存。体外循环灌注肺动脉恢复了肺循环，使保存液在肺内更加均匀分布，能更好地清除微小血管内红细胞和血栓，并且可有效除去氧自由基、激活的炎性介质和补体等细胞毒性成分，改善细胞有氧代谢，减轻肺表面活性物质的损伤，保护上皮细胞的功能，减轻离体肺缺血性损伤。体外循环灌注克服了肺微循环栓塞、肺冷却不均匀、灌洗液分布不均匀、灌注压不易控制、灌洗温度难以调节、灌注量或多或少、容易受到人主观因素的影响等低温保存不能解决的困难。

综上所述，本研究中离体肺在通气过程中以体外循环机械灌注肺循环，模拟了肺循环和心脏灌注的特点，确保恒温、灌注标准化、灌注充分均匀，更接近于肺循环的生理状态，从而有效地延长了肺保存的时限，为安全、有效、较长时间的离体肺保存创造了有利条件，为肺移植提供更好的肺源，也为肺保存方法提供了更好的研究方向。

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