AAV-HGFK1抑制EGFR磷酸化拮抗大肠癌细胞生长

邓飞鸿，聂 飚，左俊华，柳雪花，陈金敏

（南方医科大学南方医院消化科，广州510515）

大肠癌发病率是肿瘤中的第2位，而且逐年升高，占新发病数的9.4%[1]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单克隆抗体包括西妥昔单抗和帕尼单抗。其中，西妥昔单抗是一种人-鼠嵌合型IgG单克隆抗体，而帕尼单抗是一种完全人源化的IgG单抗。最初认为EGFR单抗与EGFR的细胞外区结合，从而阻断表皮细胞生长因子（EGF）等配体的结合，抑制其下游信号的传导。所以，仅被用于EGFR表达阳性的患者；但随后研究发现，EGFR表达阳性与EGFR单抗的疗效没有显著相关性，EGFR表达水平并不能作为EGFR单抗疗效的预测指标[2-3]。目前，美国国立综合癌症网络（NCCN）推荐在使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗之前，先对患者进行KRAS和BRAF基因突变检测；对于存在KRAS和BRAF突变的患者，不推荐使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗。笔者前期发现，相关病毒-肝细胞生长因子K1（AAV-HGFK1）主要通过抑制磷酸化EGFR（p-EGFR）降低大肠癌细胞增殖，选择人源的KRAS和BRAF野生的细胞株SW48，KRAS突变的细胞株Lovo，BRAF突变的细胞株HT29，用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）携带 HGFK1构建的基因治疗药物实验对大肠癌细胞的作用[4-5]。在大肠癌细胞中肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）高表达，HGFR是原癌基因c-met编码的蛋白。HGF是由链和链连接形成的，链有一个N末端发卡结构和4个螺旋结构功能区[6]。体内天然存在的突变体NK1-4与HGFR结合但不使HGFR磷酸化，成为天然的HGF拮抗剂，具有抑制肿瘤血管生成的潜在治疗作用，因为HGF参与肿瘤新生血管生成[7-9]。笔者前期发现，AAV-HGFK1主要通过抑制EGFR磷酸化降低大肠癌细胞增殖[5]，本研究选择人源的KRAS和BRAF野生的细胞株SW48、KRAS突变的细胞株Lovo，BRAF突变的细胞株HT29，用AAV携带HGFK1构建的基因治疗药物实验研究其对大肠癌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、G418、台盼蓝购自Sigma公司，羊抗人HGFK1多克隆抗体由香港大学制备，人结肠癌细胞Lovo、SW48、HT29和SW620购自ATCC公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基（含4.5g／L葡萄糖），置于37℃、5%CO2恒温箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 RNA提取和实时荧光定量PCR（RT-PCR） 六孔板中接种5×105个／孔，培养12h。总RNAs用商品化试剂盒根据说明书提取 （Trizol，Gibco BRL，USA）。10mg总RNA用SuperScriptTMⅢ（Synthesis Kit，Invitrogen，USA）逆转录为cDNA，cDNA模板用人的EGFR特异性引物PCR扩增。EGFR引物：正向，5′-AAT GTG AGC AGA GGC AGG GA-3′；反向，5′-GGC TTG GTT TGG AGC TTC TC-3′）。

1.2.3 病毒制备 质粒pAAV-CAG-sec-EGFP和pAAVCAG-sec-HGFK1是通过插入EGFP和人类HGFK1cDNA到多克隆位点AAV血清型2载体获得，重组AAV颗粒通过无辅助病毒的系统生产。

1.2.4 AAV-EGFP对体外培养细胞的转染 常规培养细胞，24孔板1×105／孔种植细胞，培养12h，设阴性对照组，弃去培养基，PBS洗2次后，病毒和无血清培养液混匀液加入24孔板的细胞中，37℃孵育2h，弃去培养基，更换新鲜的培养基，5%CO2、37℃培养4d和7d，在荧光显微镜下观察AAV和Adv感染的细胞是否表达荧光蛋白。

1.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）杂交 六孔板中种植2×105个／孔，培养过夜，细胞黏附后用AAV-EGFP或AAVHGFK1（MOI＝5×104vg／细胞）0.2%FBS的培养基孵育48 h用不同浓度的EGF同时加入培养液中继续培养24h。然后，刮取细胞，提取总蛋白为 Western blot检测备用。对于Western blot，标本先用pH 7.9含有10.0mmol／L HEPES、10.0mmol／L KCl、1.5mmol／L MgCl2、0.5mmol／L DTT、0.5 mmol／L PMSF、10.0μg／mL抑酞酶和10.0μg／mL亮肽酶素缓冲液处理。总蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，转移到硝酸纤维素膜上，经过封闭后，膜分别用一抗和二抗室温孵育1h，一抗为抗EGFR、p-EGFR和βactin（Santa Cruz Biotechnology，CA）。用ECL试剂盒检测发光信号（Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Buckinghamshire，UK）。

1.2.6 细胞增殖抑制实验 四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法测定细胞增殖，96孔板中每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20 μL反应后用 Meter Tech 960型酶标仪570nm波长下测吸光度值）。同时，用不同数量的以上种类细胞接种到96孔板中，用于建立标准曲线，用于计算细胞增殖率。同一个组设6个复孔，设对照孔（RPMI 1640培养基）和空白孔（无细胞），每个实验至少重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析。AAV-EGFP或AAV-HGFK1各组间比较采用t检验，不同浓度EGF加入细胞增殖实验采用双因素方差分析，多组间比较采用SNK法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AAV-EGFP感染后EGFP阳性率 5×104vg／细胞的AAV-EGFP感染Lovo、HT29、SW48、SW620后培养4d和7 d后，分别消化细胞制成细胞悬液，用流式细胞检测EGFP绿色荧光阳性细胞数，感染7d后阳性率均大于90%，见图1。

2.2 Lovo、HT29、SW48细胞中EGFR的表达情况 采用RT-PCR检测EGFR mRNA在Lovo和HT29细胞中转录水平较高，而SW48中的转录较低，SW620未检测到（图2）。Western blot显示HT29为45.3倍Lovo为21.5倍SW48为1.0倍，SW620未检测到，见图3。

图1 AAV-EGFP感染Lovo、HT29、SW48、SW620后时间-EGFP阳性率曲线

图2 RT-PCR检测Lovo、HT29、SW48、SW620中EGFR mRNA的表达

图3 AAV-EGFP和AAV-HGFK1感染Lovo、HT29、SW48、SW620后 Western blot检测EGFR、p-EGFR蛋白的表达

图4 感染后MTT检测4种细胞在含有EGF的无血清培养基中的生长情况

2.3 AAV-HGFK抑制EGFR磷酸化 常规培养的细胞至对数生长期进行病毒感染，7d后提取总蛋白，Western blot检测EGFR和p-EGFR，发现AAV-HGFK1感染的Lovo、HT29、SW48细胞p-EGFR显著低于AAV-EGFP感染的对照，提示AAV-HGFK1显著抑制了EGFR磷酸化，表明HGFK1是EGFR磷酸化的抑制剂，见图3。

2.4 AAV-HGFK1显著抑制了大肠癌细胞增殖 常规培养的细胞至对数生长期进行病毒感染7d后，胰酶消化细胞，将细胞悬液1×103个／孔分别接种96孔板，培养过夜贴壁作为0小时的时间点，大肠癌细胞株分别用每孔100μL无FBS的PRIM1640加入或不加EGF培养72h。2、20ng／mL的EGF显著刺激了无血清培养液中Lovo、HT29、SW48细胞的增殖，SW620的增殖无显著作用，AAV-HGFK1感染显著抑制了EGF刺激细胞生长的作用，抑制率都超过60%。为检测HGFK1是否可能通过抑制其他生长因子的作用抑制SW620的增殖，SW620在0.3%和0.6%FBS中培养，AAV-HGFK1感染对的增殖速度有显著抑制作用，抑制率为22%和26%，见图4、5。

图5 感染SW620后MTT检测基在含有FBS增养基中的生长情况

3 讨 论

HGFK1是HGF第一个Kringle环状结构域的基因表达产物，是由79个氨基酸构成的球形结构，位于 HGF的第128～206位氨基酸，相对分子质量11×105[10]。自 Xin等[11]发现HGFK1具有抑制成纤维细胞生长因子对牛动脉内皮细胞的增殖作用后，HGFK1作为一个新的抗肿瘤因子开始成为研究的焦点。

本实验通过对4种结肠癌细胞系（Lovo、HT29、SW48、SW620）分别应用RT-PCR、Western blot方法进行检测，发现在Lovo、HT29、SW48 3种细胞中可以检测到EGFR表达，在SW620细胞中未检测到。AAV-HGFK1感染Lovo、HT29、SW48细胞p-EGFR显著低于其对照组。MTT实验证明，HGFK1可以抑制EGF介导的促进Lovo、HT29、SW48肿瘤细胞生长作用，说明HGFK1可以通过EGFR信号通路抑制肿瘤细胞生长。SW620中虽然未检测到EGFR的表达，但是在含0.3%和0.6%FBS中培养，AAV-HGFK1感染对其增殖速度有显著抑制作用，说明HGFK1可以通过其他通路抑制肿瘤细胞生长。

已有研究表明，EGFR信号通路在肿瘤发生、发展中起重要作用，EGFR 主要有 Ras／Raf／MEK／ERK 和 P13K／PDKl／Akt两条信号通路[12]。以往研究发现，KRAS基因突变的患者对EGFR单抗治疗无效。而近年来也有研究发现，约40%KRAS基因野生型患者有耐药现象。究其原因可能是与EGFR表达异常及EGFR通路中的其他基因如BRAF突变等因素相关，结果导致EGFR下游的分子信号通路异常活化[13]。本研究通过体外实验表明，HGFK1对表达EGFR同时伴或不伴KRAS和BRAF突变的大肠癌细胞及不表达EGFR的大肠癌细胞有生长抑制作用，是一种肿瘤抑制因子，可能作为大肠癌治疗的新药物。这种关系的发现，为今后深入研究HGFK1治疗大肠癌提供实验依据。Shen等[14]研究发现，在肝癌细胞及微血管内皮细胞中，HGFK1抗肿瘤细胞及抗血管形成效应主要是通过EGF／EGFR信号传导通路，部分通过 VEGF／VEGFR和bFGF／Flg信号传导通路，而不是通过HGF诱导的细胞增殖效应。在大鼠肝癌模型中，AAV-HGFK1治疗组显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤微血管密度，并完全阻止肝、肺、腹膜转移。笔者前期研究已证明rAAV-HGFK1联合Ad-p53延长肝转移大肠癌小鼠生存[4]。Lu等[15]研究发现，HGFK1有效抑制人脐血管内皮细胞生长、迁移，并且在小鼠体内抑制脉络膜及视网膜新生血管形成。Zhou等[16]研究发现，表达HGFK1的非小细胞肺癌患者总生存期及无进展生存期显著长于不表达HGFK1的非小细胞肺癌患者。

综上所述，目前对HGFK1作用机制的研究正逐渐明朗，使HGFK1作为一种新型靶向治疗肿瘤药物进入临床成为可能。

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