抗血管内皮生长因子药物治疗角膜新生血管性疾病的研究进展

关文涛(综述)，崇晓霞(审校)

(1.内蒙古医科大学，呼和浩特 010050； 2.内蒙古医科大学附属医院眼科，呼和浩特 010050)

正常角膜通常为无血管状态透明组织，角膜的这种透明状态依靠的是其组成细胞和角膜各层之间一个非常复杂的平衡[1]。角膜组织上皮及基质层结构的排列规则有序，具有良好的自我保护及修复特性。角膜无血管，其营养代谢主要来自房水、泪膜及角膜缘血管网。在感染、外伤、免疫反应、排斥反应和其他病理状态下，毛细血管由角膜缘逐渐侵入角膜基质层而形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)。CNV形成的早期对消除角膜疾病有积极作用，如利于消除感染源、伤口愈合、阻止角膜基质溶解等，但在CNV形成的中晚期会产生更多不利影响，可降低角膜透明性，严重危害视力，影响穿透角膜移植术的预后。CNV还常导致组织瘢痕化、炎症、水肿等，最终导致致盲性眼病的发生。CNV导致的相关眼病的预后与角膜损伤的范围、时间、治疗方法密切相关，目前研究发现有众多因素参与CNV的形成，对这些因素的干预可以抑制CNV的形成，从而对保持角膜透明性和免疫赦免状态具有重要意义，也为众多由于角膜血管化而导致的角膜疾病的治疗提供指导。

1 血管内皮生长因子及其受体

通常，角膜血管化是由于促血管生成因子 [如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基本成纤维细胞生长因子等]增多、基质金属蛋白酶或抗血管生成因子缺乏使抑制血管生成和促进血管生成的平衡被打破而导致的。大量研究表明，CNV的生长受多种因素综合调控，各种细胞因子在其发生和发展中起着重要作用，其中VEGF是目前公认的功能最强的新生血管形成促进因子[2]。VEGF是一种分泌生长因子肽，属于一个基因家族，包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子。其中，除了VEGF-E为编码的痘病毒，其余均为哺乳动物编码肽[3]。VEGF-A为主要作用因子，而VEGF-C和VEGF-D是关键调节因子。也有研究表明,VEGF-A在调节新生血管生成方面的作用也很重要[4]。VEGF-A包括8个外显子和7个内含子，其转录剪接成多个亚型，主要为：VEGF121、VEGF145、VEGF206、VEGF165、VEGF189，这些亚型有不同的分子质量、溶解度和肝素结合能力，其中VEGF165是最主要的亚型[5]。VEGF-A的主要作用为促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔的形成，同时也会增加血管渗漏、促进单核细胞趋化和B细胞生成。VEGF-A的生物学效应是依靠与其特异性受体结合而介导的，与其结合的主要是特异性受体血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR-1)和VEGFR-2。其中，VEGFR-2被认为是主要的VEGFR，其对血管内皮细胞的增生有重要影响。VEGFR-2通过细胞内激酶诱导VEGF绑定二聚体和需要自身磷酸化的受体，从而加强细胞的有丝分裂[6]。VEGF-C和VEGF-D主要与VEGFR-3特异性结合，从而发挥其生物学效应。

2 抗VEGF药物

近期，随着抗VEGF药物的研发及应用，抗VEGF药物在眼部疾病尤其是眼部血管增生性疾病中的治疗中起着极为重要作用。研究显示,抗VEGF药物通过抑制鼠可溶性受体蛋白mFlt(1-3)免疫球蛋白G，从而减少继发于单纯疱疹病毒的CNV[7]。临床应用发现抗VEGF药物可有效地治疗CNV，并可有效治疗其他眼部疾病，如新生血管性年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和新生血管性青光眼等[8]。近年来，众多研究和临床试验证明了贝伐单抗(Bevacizumab)、雷珠单抗(Lucentis)等在治疗眼底疾病上的疗效和安全性[9]。

2.1贝伐单抗 贝伐单抗是一种小鼠单克隆抗体，相对分子质量约149×103，可识别所有的亚型VEGF，其抗新生血管的主要机制为阻止VEGF与内皮细胞表面VEGFR-l和VEGFR-2结合，使内源化VEGF的生物活性失效，抑制内皮细胞有丝分裂，减少血管通透性，从而阻断新生血管的形成[10]。贝伐单抗最初被美国食品和药品管理局批准用于治疗转移性结肠癌，因其具有较强的抗VEGF能力，在直肠癌的治疗中发挥着重要作用[11]。随着对贝伐单抗结构、作用机制的不断深入研究，它的适用范围越来越广泛。在眼科领域，它被用于血管增生性疾病治疗，并且取得了很好的治疗效果。许多研究表明,其在治疗眼部新生血管性疾病及年龄相关性黄斑变性疾病中也具有一定疗效[12-13]。临床试验表明，贝伐单抗在对年龄相关性黄斑变性病变的治疗中，可以有效抑制活动性新生血管和黄斑水肿，使视网膜新生血管明显衰退，显著提高视力[14]。玻璃体腔内注射贝伐单抗是安全有效的给药方式，且对眼压的影响较小[15]。此外，近年大量研究表明，局部、结膜下或眼内应用贝伐单抗时，CNV的生成也相应减少[16-22]。

2.2雷珠单抗 雷珠单抗由贝伐单抗的部分抗体片段衍生加工而成，是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片段，能结合VEGF165、VEGF121和VEGF110，较贝伐单抗具有更低的免疫原性和更强的穿透力[23]。它能与VEGFR高度亲和，通过非特异性地与所有活化形式的VEGF-A结合，抑制VEGF和VEGFR的相互作用,从而减少新生血管生成。其与贝伐单抗具有类似功效，并于2006年6月被美国食品和药品管理局批准用于治疗渗出型老年性黄斑变性。已有研究表明,玻璃体腔内注射雷珠单抗24个月后患者的视力优于光动力学疗法[24]。但因该种药物价格比较昂贵，其用于CNV疾病的治疗还相对较少。Dursun等[25]于2012年报道，雷珠单抗对碱烧伤兔角膜引起的新生血管具有抑制作用。

2.3加他尼钠 加他尼钠(Pegaptanib)是一个含有28个碱基对的核糖核酸适体，其与VEGF165具有高亲和力，可与其特异性结合，从而阻断其生物活性，是可治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性的抗VEGF药物。加他尼钠只能特异性结合VEGF165亚型，其他亚型不受影响，所以它的治疗效果与雷珠单抗和贝伐单抗相比较弱，但因其安全性可能会在未来时间内大量用于维持治疗[26]。

2.4VEGF陷阱 VEGF陷阱(VEGF-trap)是VEGFR-1和VEGFR-2的胞外段与人免疫球蛋白G相连接的Fc片段所形成的融合蛋白，具有比抗VEGF单抗更强的VEGF亲和力，能伪装成VEGFR诱使VEGF与其结合，从而阻断VEGF的信号转导。VEGF陷阱是目前亲和力最高的VEGF阻滞剂，是所有VEGF亚型的受体诱饵。正因为如此，它可以绑定胎盘生长因子1和胎盘生长因子2，以提高抗血管新生的反应。VEGF陷阱的另一优势是延长新生血管生成时间。研究表明，玻璃体腔内注射VEGF陷阱后79 d与注射雷珠单抗后30 d的新生血管生长情况大致相同[27]。VEGF陷阱在治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿的耐受性及安全性已被证实[28-30]。近年来,也有相关动物实验研究表明VEGF陷阱预防CNV有疗效。Cursiefen等[4]给角膜移植术后的小鼠腹腔注射VEGF陷阱发现,其能显著减少小鼠角膜移植术后CNV的形成，并延长移植物的存活时间。

2.5RNA沉默技术 RNA沉默技术为一种抗VEGF生成方法，即将细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，会诱发内源性mRNA发生降解，从而阻断目的基因的表达。沉默RNA有能力穿越细胞边界参与抑制转录后加工，一个沉默RNA的作用要优于抗VEGFR，它可以把细胞内和细胞外的VEGF和VEGFR8作为攻击目标[31]。研究表明,沉默RNA并不是复制细胞，可能只是瞬时效应，但目前正在实验审核中的沉默RNA药物贝伐西尼和小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)-027(目标为VEGF和VEGFR-1)在治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性中已显示出积极的疗效[32]。目前有研究表明，siRNA可降低人类角膜细胞VEGF表达及减少鼠CNV生成的数量[33]。Kim等[34]采用3种针对VEGF或VEGFR的siRNA及其混合物，分别对单纯疱疹性角膜基质炎引起的CNV化动物模型以及通过含有核糖酸对的寡聚脱氧核苷酸的微囊诱导的CNV化动物模型进行治疗，通过结膜下或全身静脉注射，结果发现3种siRNA都能显著抑制CNV的形成，其中3种siRNA的混合物的抗新生血管能力最强，不管是结膜下局部注射还是全身静脉用药，都能有效阻止CNV的发生。

3 展 望

目前，治疗CNV的传统方法包括局部皮质类固醇和非甾体类抗炎药物治疗、光动力疗法、激光光凝术、细针透热疗法、角膜缘干细胞移植和羊膜移植等[35]。然而，这些的临床疗效都很有限，并且还可导致诸多不良作用，例如：皮质类固醇的使用可导致眼压升高，诱发后囊下白内障等。

综上所述，抗VEGF药物能有效地抑制CNV的形成，其用于治疗CNV性疾病已取得了较好的近期疗效。但VEGF并不是唯一参与CNV的因子，其他血管生成或抗血管新生分子包括：成纤维细胞生长因子1和成纤维细胞生长因子2、矩阵金属蛋白酶类、血管生成素、血管内皮抑制素、胰岛素样生长因子、血小板源胎盘生长因子、生长因子等诸多因子也参与CNV的形成。人们发现联合应用血小板衍生生长因子和加他尼钠可以比单一应用一种疗法更加有效地抑制CNV的生成，在实验中，联合疗法的治愈率是单独应用贝伐单抗疗法的2.9倍[36]。这种联合疗法将会为未来CNV治疗提供一个更好、更有效的方法。进一步研究可揭示更多有效的治疗组合，而大样本随机可控的临床试验必不可少。如何建立安全的剂量和方法管理使药物可用于临床治疗，有待于将来进一步研究。

[1] DelMonte DW,Kim T.Anatomy and physiology of the cornea[J].J Cataract Refract Surg,2011,37(3):588-598.

[2] Lai CM,Spilsbury K,Brankov M,etal.Inhibition of corneal neovascularization by recombinant adenovirus mediated antisense VEGF RNA[J].Exp Eye Res,2002,75(6):625-634.

[3] Lyttle DJ,Fraser KM,Fleming SB,etal.Homologs of vascular endothelial growth factor are encoded by the poxvirus orf virus[J].J Virol,1994,68(1):84-92.

[4] Cursiefen C,Chen L,Borges LP,etal.VEGF-A stimulates lymphangiogenesis and hemangiogenesis in inflammatory neovascularization via macrophage recruitment[J].J Clin Invest,2004,113(7):1040-1050.

[5] Ferrara N,Gerber HP,LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med,2003,9(6):669-676.

[6] Klettner A,Roider J.Treating age-related macular degeneration-interaction of VEGF-antagonists with their target[J].Mini Rev Med Chem,2009,9(9):1127-1135.

[7] Zheng M,Deshpande S,Lee S,etal.Contribution of vascular endothelial growth factor in the neovascularization process during the pathogenesis of herpetic stromal keratitis[J].J Virol,2001,75(20):9828-9835.

[8] Tolentino M.Systemic and ocular safety of intravitreal anti-VEGF therapies for ocular neovascular disease[J].Surv Ophthalmol,2011,56(2):95-113.

[9] Tufail A,Patel PJ,Egan C,etal.Bevacizumab for neovascular age related macular degeneration(ABC Trial):multicentre randomised double masked study[J].BMJ,2010,340:c2459.

[10] 于问利,毕宏生.Avas tin在眼科应用的研究进展[J].国际眼科杂志,2008,8(4):810-812.

[11] Bakri SJ,Snyder MR,Pulido JS,etal.Six-month stability of bevacizumab(Avastin)binding to vascular endothelial growth factor after withdrawal into a syringe and refrigeration or freezing[J].Retina,2006,26(5):519-522.

[12] Avila MP,Farah ME,Santos A,etal.Three-year safety and visual acuity results of epimacular 90 strontium/90 yttrium brachytherapy with bevacizumab for the treatment of subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration[J].Retina,2011,32(1):10-18.

[13] Krebs I,Lie S,Stolba U,etal.Efficacy of intravitreal bevacizumab(Avastin)therapy for early and advanced neovascular age-related macular degeneration[J].Acta Ophthalmol,2009,87(6):611-617.

[14] Spaide RF,Laud K,Fine HF,etal.Intravitreal bevacizumab treatment of choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration[J].Retina,2006,26(4):383-390.

[15] Song H,Ren B,Gao XW.Effect of bevacizumab(avastin)on eye diseases[J].Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi),2008,8(6):1230-1232.

[16] Gueudry J,Richez F,Tougeron-Brousseau B,etal.Subconjunctival bevacizumab for corneal neovascularization[J].J Fr Ophtalmol,2010,33(9):630-636.

[17] Hashemian MN,Z-Mehrjardi H,Moghimi S,etal.Prevention of corneal neovascularization:comparison of different doses of subconjunctival bevacizumab with its topical form in experimental rats[J].Ophthalmic Res,2011,46(1):50-54.

[18] Hashemian MN,Zare MA,Rahimi F,etal.Deep intrastromal bevacizumab injection for management of corneal stromal vascularization after deep anterior lamellar keratoplasty,a novel technique[J].Cornea,2011,30(2):215-218.

[19] Kim SW,Ha BJ,Kim EK,etal.The effect of topical bevacizumab on corneal neovascularization[J].Ophthalmology,2008,115(6):e33-38.

[20] You IC,Kang IS,Lee SH,etal.Therapeutic effect of subconjunctival injection of bevacizumab in the treatment of corneal neovascularization[J].Acta Ophthalmol,2009,87(6):653-658.

[21] Zaki AA,Farid SF.Subconjunctival bevacizumab for corneal neovascularization[J].Acta Ophthalmol,2010,88(8):868-871.

[22] Oh JY,Kim MK,Wee WR.Subconjunctival and intracorneal bevacizumab injection for corneal neovascularization in lipid keratopathy[J].Cornea,2009,28(9):1070-1073.

[23] 王嘉因，柯碧莲.抑制血管内皮生长因子活性治疗角膜新生血管形成[J].上海交通大学学报,2009,29(7)：886-889.

[24] Sadda SR,Stoller G,Boyer DS,etal.Anatomical benefit from ranibizumab treatment of predominantly classic neovascular age-related macular degeneration in the 2-year anchor study[J].Retina,2010,30(9):1390-1399.

[25] Dursun A,Arici MK,Dursun F,etal.Comparison of the effects of bevacizumab and ranibizumab injection on corneal angiogenesis in an alkali burn induced model[J].Int J Ophthalmol,2012,5(4):448-451.

[26] Pieramici DJ,Rabena MD.Anti-VEGF therapy:comparison of current and future agents[J].Eye(Lond),2008,22(10):1330-1336.

[27] Stewart MW,Rosenfeld PJ.Predicted biological activity of intravitreal VEGF Trap[J].Br J Ophthalmol,2008,92(5):667-668.

[28] Brown DM,Heier JS,Ciulla T,etal.Primary endpoint results of a phase II study of vascular endothelial growth factor trap-eye in wet age-related macular degeneration[J].Ophthalmology,2011,118(6):1089-1097.

[29] Heier JS,Boyer D,Nguyen QD,etal.The 1-year results of CLEAR-IT 2,a phase 2 study of vascular endothelial growth factor trap-eye dosed as-needed after 12-week fixed dosing[J].Ophthalmology,2011,118(6):1098-1106.

[30] Natoli C,Perrucci B,Perrotti F,etal.Tyrosine kinase inhibitors[J].Curr Cancer Drug Targets,2010,10(5):462-483.

[31] Zuo L,Fan Y,Wang F,etal.A siRNA targeting vascular endothelial growth factor-A inhibiting experimental corneal neovascularization[J].Curr Eye Res,2010,35(5):375-384.

[32] Kaiser PK,Symons RC,Shah SM,etal.RNAi-based treatment for neovascular age-related macular degeneration by Sirna-027[J].Am J Ophthalmol,2010,150(1):33-39.

[33] Singh N,Higgins E,Amin S,etal.Unique homologous siRNA blocks hypoxia-induced VEGF upregulation in human corneal cells and inhibits and regresses murine corneal neovascularization[J].Cornea,2007,26(1):65-72.

[34] Kim B,Tang Q,Biswas PS,etal.Inhibition of ocular angiogenesis by siRNA targeting vascular endothelial growth factor pathway genes:therapeutic strategy for herpetic stromal keratitis[J].Am J Pathol,2004,165(6):2177-2185.

[35 ] Shakiba Y,Mansouri K,Arshadi D,etal.Corneal neovascularization:molecular events and therapeutic options[J].Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov,2009,3(3):221-231.

[36] He J,Eastlack JP,Bazan HE.The induction of an angiogenic response in corneal myofibroblasts by platelet-activating factor(PAF)[J].Curr Eye Res,2010,35(12):1063-1071.