微囊藻毒素－LR与癌症发生发展的分子机制研究进展

周丽华 王 婷

1 南京医科大学2012级临床专业6班，江苏省南京市 210029； 2 南京医科大学基础医学院细胞生物学系

随着人类生活方式的改变，工业化、城市化的发展以及农业生产大量使用化肥，大量的营养物质注入水体，湖泊富营养化日益严重，严重影响了水质和环境卫生。天然水体富营养化已成为我国乃至世界所面临的重大环境污染问题之一。目前，世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋势，发生的地点遍布全球各地。欧洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分别是53%、28%、48%和4l%［1］。在我国，90年代以来，淡水水体的富营养化状况更加严重。60%的天然淡水湖泊有不同程度的富营养化污染现象。由此造成的蓝藻爆发是当今人类面临的严重问题。其中，微囊藻属爆发引起的水体微囊藻毒素（microcystins，Mcs）污染对人类的健康的影响尤其令人关注。微囊藻毒素－LR（microcystin－LR，MC－LR）是毒性最强的微囊藻毒素之一，对自然界生物有着严重的毒性作用，且具有明显的器官选择性毒性包括肝脏毒性、肾毒性、神经毒性等，同时与人群的原发性肝癌、大肠癌以及急性肝出血、肝坏死有关。本文就针对微囊藻毒素－LR与癌症发生、发展的关系进行综述。

1 微囊藻毒素－LR通过调节PP1，PP2A调节细胞的生命活动

细胞内许多重要的生理功能都依赖于蛋白激酶和蛋白磷酸酶对磷酸化和去磷酸化的精细调节，其中，丝／苏氨酸蛋白磷酸酶1及2A（protein phosphatase1and 2A，分别简写为PPI，PP2A）扮演了尤为重要的角色。PP2A参与了细胞的增殖、代谢、分化、DNA修复、凋亡等几乎所有生理活动。在体内至少有75种PP2A全酶的组合，这与其众多的生理作用密切相关［2］。

PP2A是MC－LR在细胞内的主要靶点，具有抑制细胞恶性转化和促进细胞凋亡的功能［3，4］。MCLR直接与PP2A结合而造成PP2A活性损失，进而导致细胞内蛋白过磷酸化出现一系列生物化学改变，是MC－LR造成细胞损伤最重要的机制［5］。MCLR对细胞内PP2A总体活性表现出低浓度促进、高浓度抑制的双重效应，但体外实验时只表现为强抑制性，这说明了MC－LR能引起细胞对PP2A的代偿调节，包括产生神经酰胺上调部分PP2A全酶活性［6］、PP2A／C与α4蛋白解离以代偿PP2A活性损失［7］等。现已证明MC－LR既能造成细胞凋亡，又具有促癌作用。细胞暴露于MC－LR后，进行凋亡还是恶性转变的命运选择，可能取决于细胞内不同PP2A的活性以及细胞对PP2A的调节机制。

2 微囊藻毒素－LR与染色体不稳定性

染色质多倍体的形成和染色质不稳定性是肿瘤细胞最常见的异常现象，其主要产生于分裂时子细胞染色质的不对称分配［8］。Nek2（NIMA－related kinase 2）属于丝氨酸／苏氨酸激酶，它集中于着丝粒，通过底物磷酸化调节纺锤体的形成和分离，从而调节染色质的分配［9］。Nek2广泛高表达于多种肿瘤［10］。Nek2的激活主要通过自体磷酸化、蛋白磷酸酶抑制剂的加入，或者PP1的减少［11］。有研究证明微囊藻毒素－LR与PP1的结合也能激活Nek2［12］。因此，微囊藻毒素－LR的促癌作用可能通过染色体的不对称分裂有关，进而产生病理性核分裂，使细胞出现癌细胞的特征。

3 微囊藻毒素－LR与肿瘤的侵袭转移

最近研究表明，微囊藻毒素与肿瘤的侵袭转移有关。肿瘤的侵袭转移需要依靠降解细胞外基质的基质金属蛋白酶（MMP）。在黑色素瘤细胞MDAMB－435中，微囊藻毒素可以通过PI3－K／AKT／NFκB上调MMP－2／－9表达的促进肿瘤细胞的侵袭转移［13，14］。AKT的磷酸化，可由PP2A和PDK1调节，AKT的Ser473主要被PDK1磷酸化，但在HEK293－OATP1B3中，微囊藻毒素－LR对PDK1磷酸化作用不显著［15］。而PTEN作为主要的PI3－K／AKT负调节剂，可以去磷酸化PIP3为PIP2。有研究表明，微囊藻毒素－LR可以降低PTEN的表达［16］。因此微囊藻毒素主要通过强烈抑制磷酸酶PP2A的活性和抑制PTEN的表达，导致AKT的活化，进而促进肿瘤的侵袭转移。

4 微囊藻毒素－LR与癌基因、抑癌基因及其表达产物

4.1 微囊藻毒素－LR与C－myc C－Myc蛋白由细胞内重要原癌基因C－myc编码，C－myc过度表达以及C－Myc在细胞内的积聚对细胞恶性转化起关键作用。MC－LR可直接通过增强C－myc表达促癌。而PP2A／B56a型全酶可实现C－Myc蛋白Ser62的去磷酸化，使其进入泛素一蛋白酶降解体系，从而抑制其在细胞内的累积［17］。所以，MC－LR还可通过调节PP2A／B56a型全酶活性调节细胞恶性转化。

4.2 微囊藻毒素－LR与Bcl－2 Bcl－2蛋白家族中既有促凋亡蛋白如Bad、Bax，也有抗凋亡蛋白如Bcl－2。MC－LR可以通过调节转录调节因子p53调控bcl－2基因表达（上调促凋亡基因，下调抗凋亡基因）促进细胞凋亡。Bcl－2蛋白家族同时是PP2A／B56a型全酶的直接底物，PP2A／B56a型全酶可以通过去磷酸化Bcl－2以及Bad，使其分别处于失活和活化状态来诱导凋亡［4］。MC－LR是否同CIP2A（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A）一样通过抑制PP2A／B56a型全酶活性［18］而实现对细胞的恶性转化尚未定论。

4.3 微囊藻毒素－LR与Rb RB蛋白家族由抑癌基因Rb编码，为核内转录调节因子，能与E2F蛋白结合而抑制与细胞增殖相关基因的转录。其成员P107和P130的激活依赖于PP2A的去磷酸化［19］。而MC－LR抑制PP2A活性，使RB蛋白处于失活状态，导致细胞恶性转化。

5 微囊藻毒素－LR与细胞凋亡

研究表明，MC－LR可以促进肝细胞的凋亡。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。表现为细胞核浓缩，细胞器密集，胞膜突起，体积缩小，DNA断裂及形成凋亡小体［20］。其机制主要在于：

5.1 MC－LR通过激活MAPK信号通路促进细胞凋亡。当MC－LR使α4与pp2A严重解离时，α4失去稳定核心酶以及抗凋亡的作用，PP2A核心酶部分解离活性丧失，将激活MAPK信号通路（包括ERK1／2，JNK和p38），诱导细胞凋亡。而MAPK信号通路的抑制剂，能显著抑制微囊藻毒素－LR的促凋亡作用［21］。

5.2 MC－LR通过上调CAPP促进细胞凋亡。神经酰胺是细胞内一类主要的第二信使，能传递多种外界刺激包括热激、氧化应激、UV、TNF－α等，它的一个重要作用机制是能上调细胞内PPl和PP2A的活性从而促进细胞凋亡［22］。被神经酰胺上调的PP2A全酶被称作CAPP（ceramide activated protein phosphatases）［23］，包括PP2A／B55a型和PP2A／B56ct型全酶，能产生与细胞凋亡相关的细胞学效应，如Bad蛋白磷酸化比例下降。

5.3 激酶钙离子依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）在MC－LR诱导的凋亡过程中起关键作用。有研究发现，在微囊藻毒素－LR诱导的凋亡早期就发生了磷酸化蛋白数量明显增加的现象，而加入蛋白激酶CaMKⅡ的抑制剂后，蛋白质磷酸化现象乃至凋亡都被阻滞，证实激酶CaMKⅡ介导的蛋白质磷酸化升高现象作用贯穿于微囊藻毒素－LR诱导的整个凋亡过程。Krakstad等发现，CaMKⅡ的激活在产生活性氧（ROS）之前，而CaMKⅡ的激活是通过抑制蛋白磷酸酶对它的去磷酸化，这可能是微囊藻毒素－LR通过抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性实现的［24，25］。

5.4 微囊藻毒素－LR也可以通过抑制PP2A来调节P53促进细胞的凋亡。P53蛋白是一种非常重要的凋亡调节因子［26］，它也是PP2A的底物之一［27］。因此，在人胚肾HEK293－OATP1B3细胞中，微囊藻毒素－LR可以通过促进P53的Ser46磷酸化诱导细胞凋亡。由于p53的下游基因p21编码的蛋白是一个依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶抑制剂，因此，P53和P21的上调还可能跟细胞周期阻滞有关［15］。除此以外，P53可以调节Bcl－2家族调控凋亡。Bcl－2家族在细胞凋亡调控中有重要的作用，Bcl－2和bax分别是Bcl－2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白。Bcl－2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，具有促凋亡作用［28，29］。体外实验表明，微囊藻毒素－LR可以上调P53和Bax的表达，降低Bcl－2的表达来促进大鼠肝细胞的凋亡［30］。

5.5 凋亡关键蛋白caspase－3是否参与MC－LR诱导的细胞凋亡可能依赖于细胞类型和毒素作用时间，尚无定论。在TNF、DNA损伤等促凋亡信号的作用下，初始型caspase被激活从而激活下游的效应型caspase如caspase－3，使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活，从而导致细胞凋亡。Fladmark等用caspase－3的特异性抑制剂ZVADfmk作用于原代大鼠肝细胞后成功抑制了MC－LR诱导的细胞凋亡［31］，但也有实验得出相反结论。

5.6 微囊藻毒素－LR下调CDKs，调节细胞凋亡。CDKs（周期依赖性蛋白激酶）属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，CDKs被细胞周期蛋白时相性地激活是细胞周期调控的核心［32］。MC－LR下调CDKs将导致细胞周期的阻滞及细胞凋亡［33］。其机制是：MC－LR通过上调转录调节因子p53从而激活其下游基因p21，编码周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKI，抑制CDKs使其不能被时相性地激活。

微囊藻毒素－LR由于其强促癌性而被广泛研究。MC－LR对PP2A的强抑制作用是其细胞毒性的主要机制，其他机制大多直接或间接与PP2A活性被抑制相关，由此而产生的改变成为了MC－LR毒性作用最重要的分子基础。MC－LR促进癌症发生、发展的机制有：激活Nek2降低染色体稳定性，活化AKT促进肿瘤的侵袭转移，上调C－Myc、Bax同时下调RB及Bcl－2等。此外，肿瘤的发生与细胞凋亡的调节失控密切相关。MC－LR可以通过抑制PP2A上调P53、下调CDKs、激活CaMKⅡ以及MAPK信号通路促进细胞凋亡，还可能通过上调CAPP等促进细胞凋亡。虽然目前已经开展了大量对微囊藻毒素毒性的研究，但是仍然存在很多问题未明了。比如：微囊藻毒素诱导细胞走向凋亡或恶性转换的平衡点及其影响因素，细胞内不同PP2A对MC－LR刺激的反应及产生的细胞学效应。

［1］ Chorus I，Bartram J.Toxic cyanobacteria in water：A guide to their public health consequences，monitoring and management〔M〕.Spon Press，1999.

［2］ Janssens V Goris J，Van Hoof C.PP2A：The expected tumor suppressor〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2005，15（1）：34－41.

［3］ Mumby M.PP2A：unveiling a reluctant tumor suppressor〔J〕.Cell，2007，130（1）：21－24.

［4］ Van Hoof C，Goris J.Phosphatases in apoptosis：to be or not to be，PP2Ais in the heart of the question〔J〕.Biochim Biophys Acta，2003，1640（2－3）：97－104.

［5］ Gehringer MM.Microcystin－LR and okadaic acid－induced cellular effects：a dualistic response〔J〕.FEBS Lett，2004，557（1－3）：1－8.

［6］ Saddoughi SA，Gencer S，Peterson YK，et al.Sphingosine analogue drug FTY720targets 12PP2A／ET and mediates lung tumour suppressionn via activation of PP2A－RIPKl－dependent necroptosis〔J〕.EMBO Mol Med，2013，（5）：105－121.

［7］ Kong M，Ditsworth D，Lindsten T，et al.Alpha4is an essential regulator of PP2Aphosphatase activity〔J〕.Mol Cell，2009，36（1）：51－60.

［8］ Zhivotovsky B，Kroemer G.Apoptosis and genomic instability〔J〕.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2004，5：752－762.

［9］ Whelligan DK，Solanki S，Taylor D，et al.Aminopyrazine inhibitors binding to an unusual inactive conformation of the mitotic kinase Nek2：SAR and structural characterization〔J〕.Journal of medicinal chemistry，2010，53：7682－7698.

［10］ Hayward DG，Fry AM.Nek2kinase in chromosome instability and cancer〔J〕.Cancer letters，2006，237：155－166.

［11］ Helps N，Luo X，Barker H，et al.NIMA－related kinase 2（Nek2），a cell－cycle－regulated protein kinase localized to centrosomes，is complexed to protein phosphatase 1〔J〕.Biochemical Journal，2000，349：509－518.

［12］ Li M，Satinover DL，Brautigan DL.Phosphorylation and functions of inhibitor－2family of proteins〔J〕.Biochemistry，2007，46：2380－2389.

［13］ Zhang X－X，Fu Z，Zhang Z，et al.Microcystin－LR promotes melanoma cell invasion and enhances matrix metalloproteinase－2／－9expression mediated by NF－κB activation〔J〕.Environmental Science ＆Technology，2012，46（20）：11319－11326.

［14］ Xu P，Zhang XX，Miao C，et al.Promotion of Melanoma Cell Invasion and Tumor Metastasis by Microcystin－LR via Phosphatidylinositol 3－Kinase／AKT Pathway〔J〕.Environmental Science ＆Technology，2013，47（15）：8801－8808.

［15］ Takumi S，Komatsu M，Furukawa T，et al.p53Plays an Important Role in Cell Fate Determination after Exposure to Microcystin－LR〔J〕.Environmental Health Perspectives，2010，118（9）：1292－1298.

［16］ Shehata M，Schnabl S，Demirtas D，et al.Reconstitution of PTEN activity by CK2inhibitors and interference with the PI3－K／Akt cascade counteract the antiapoptotic effect of human stromal cells in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Blood，2010，116（14）：2513－2521.

［17］ Sears RC.The life cycle of C－Myc from synthesis to degradation〔J〕.Cell Cycle，2004，3（9）：1133－1137.

［18］ Junttila MR，Puustinen P，Niemela M，et al.CIP2Ainhibits PP2Ain human malignancies〔J〕.Cell，2007，130（1）：51.

［19］ Vuocolo S，Purev E，Zhang D，et al.Protein Phosphatase 2A associates with Rb2／p130and mediates retinoic acid－induced growth suppression of ovarian carcinoma cells〔J〕.Journal of biological chemistry，2003，278（43）：41881－41889.

［20］ Jacobson MD，Weil M，Raff MC.Programmed cell death in animal development〔J〕.Cell，1997，88（3）：347－354.

［21］ Komatsu M，Furukawa T，Ikeda R，et al.Involvement of mitogen－activated protein kinase signaling pathways in microcystin－LR－induced apoptosis after its selective uptake mediated by OATP1B1and OATP1B3〔J〕.Toxicological Sciences，2007，97（2）：407－416.

［22］ Zeidan YH，Hannun YA.The acid sphingomyelinase／ceramide pathway：biomedical significance and mechanisms of regulation〔J〕.Curr Mol Med，2010，10（5）：454－466.

［23］ Galadari S，Kishikawa K，Kamibayashi C，et al.Purification and characterization of ceramide－activated protein phosphatases〔J〕.Biochemistry，1998，37（32）：11232－11238.

［24］ Fladmark KE，Brustugun OT，Mellgren G，et al.Ca2＋／calmodulin－dependent protein kinase II is required for microcystininduced apoptosis〔J〕.Journal of Biological Chemistry，2002，277（4）：2804－2811.

［25］ Krakstad C，Herfindal L，Gjertsen B，et al.CaM－kinaseII－dependent commitment to microcystin－induced apoptosis is coupled to cell budding，but not to shrinkage or chromatin hypercondensation〔J〕.Cell Death ＆Differentiation，2006，13（7）：1191－1202.

［26］ Moll UM，Zaika A.Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53〔J〕.FEBS letters，2001，493（2－3）：65－69.

［27］ Li HH，Cai X，Shouse GP，et al.A specific PP2Aregulatory subunit，B56gamma，mediates DNA damage－induced dephosphorylation of p53at Thr55〔J〕.Embo Journal，2007，26（2）：402－411.

［28］ Miyashita T，Krajewski S，Krajewska M，et al.Tumor suppressor p53is a regulator of bcl－2and bax gene expression in vitro and in vivo〔J〕.Oncogene，1994，9（6）：1799－1805.

［29］ Morselli E，Galluzzi L，Kroemer G.Mechanisms of p53－mediated mitochondrial membrane permeabilization〔J〕.Cell Research，2008，18（7）：708.

［30］ Fu WY，Chen JP，Wang XM，et al.Altered expression of p53，Bcl－2and Bax induced by microcystin－LR in vivo and in vitro〔J〕.Toxicon，2005，46（2）：171－177.

［31］ F1admark KE，Brustugun 0T，Hovland R，et al.Ultrarapidcaspase－3dependent apoptosisinduction by serine／threonine phosphatase inhibitors〔J〕.Cell Death Differ，1999，6（11）：1099－1108.

［32］ Hunter T，Pine J.Cyclins and cancer.II：Cyclin D and CDK inhibitors come of age〔J〕.Cell，1994，79（4）：573－582.

［33］ Wang YF，Chen NS，Chung YP，et al.Sodium butyrate induces apoptosis and cell cycle arrest in primary effusion lymphoma cells independently of oxidative stress and p21（CIP1／WAF1）induction〔J〕.Mol Cell Biochem，2006，285（1－2）：51－59.