自身免疫糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体表位的研究

沈 威(综述)，黄 干(审校)

(中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所，长沙 410011)

自身免疫糖尿病包括1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)和成人隐匿性自身免疫糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults，LADA)，其发病机制较复杂，主要与T细胞介导的胰岛细胞的免疫损伤有关，另外，体液免疫也参与其中。在胰岛β细胞的损伤过程中暴露更多的胰岛自身抗原，从而产生一系列相关的胰岛自身抗体，其中谷氨酸脱羧酶抗体(glutamic acid decarboxylase antibody，GADA)的阳性率最高，它是诊断和预测自身免疫糖尿病的重要指标[1]。随着研究的进一步深入，人们发现GADA针对谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)的表位变化可能与疾病的发生、发展有一定的关联，可能为临床诊断提供更多的证据。

1 自身免疫糖尿病的发生

T1DM的发生比较复杂，主要与遗传因素、环境因素以及免疫因素等有关。Th1细胞分泌白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-2、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis fator-α，TNF-α)等提高T细胞的杀伤活性，加强CD8+T细胞对胰岛β细胞的损害。但Th2细胞分泌的IL-2、-6、-10、-13等对胰岛β细胞有保护作用，Treg细胞被认为是一种具有免疫抑制效应的细胞，其同样也具有保护胰岛β细胞的作用。因此有学者认为，T1DM的发生可能与自身免疫耐受被打破有关，以毒性T细胞损伤为主。B细胞作为非特异性抗原呈递细胞可以将抗原呈递给T细胞，并分泌共同刺激因子作用于T细胞，在抗原和共同刺激因子的作用下活化T细胞，同时B细胞还可以分泌与胰岛自身抗原相关的自身抗体，分泌的自身抗体还可能参与抗体依赖的细胞毒性作用，加强T细胞对胰岛β细胞的损伤。由此可知，在T细胞的不断破坏下，胰岛功能逐渐减弱，最终发展为T1DM[2]。而胰岛自身抗体GADA、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、胰岛素自身抗体等的产生是T1DM中体液免疫的直接证据[3]。多种胰岛自身抗体的阳性对预测T1DM有重要价值[4]。

2 GADA表位与T1DM

GAD包括GAD65和GAD67两种酶，GADA表位是指GAD65分子中某几个连续的氨基酸序列组成的一段肽链或某几个不连续的氨基酸残基组成的一个空间结构。GAD65A在新诊断的T1DM患者中出现的频率比GAD67A明显要高[5]，而GAD65与GAD67结构相似，因此可以将合成GAD65和GAD67的基因通过融合技术合成几种主要的线性表位，即GAD65 C端(第445个氨基酸至第585个氨基酸)，GAD65 M段(第96个氨基酸至第444个氨基酸)以及GAD65 N端(第1个氨基酸至第95个氨基酸)[6-7]。采用单克隆抗体技术可合成构象型表位(EP-1，EP-2，EP-3)[8]。目前针对GAD65的单克隆抗体主要包括DPA、DPD、DPB、DPC、b96.11，其中DPA主要针对GAD65 C端，b96.11主要针对GAD65 M段，DPD、DPB、DPC主要针对GAD65 N端[9]。

Hampe等[10]研究了25例GADA阳性的健康成年人发生T1DM的危险，通过10年随访发现，在糖尿病前期，GAD65发生表位动态变化，而发生T1DM的患者其GADA与GAD65 M段以及GAD65 C端发生反应的频率增高，提示GAD65表位动态变化至GAD65-M+CAb同时阳性的健康成人发生T1DM的概率增高。另有研究发现，胎儿血中GADA针对GAD65 N端反应的频率较高，而针对GAD65 M端、GAD65 C端以及GAD65 M+C段的频率较低，然而诊断为T1DM的新生儿脐带血中GADA与GAD65 M段、GAD65 C端以及GAD65 M+C结合的频率升高，而与GAD65 N端结合的概率明显降低，提示GAD65表位动态变化至GAD65-MAb和GAD65-CAb同时阳性可增加发生T1DM的风险。上述研究虽然提示表位变化与T1DM发病有关，但未发现与T1DM特异性相关的表位[11]。

Fenalti等[12]采用11种针对GAD65不同表位(主要包括GAD65 C端、GAD65 M段、GAD65 N端)的单克隆抗体分析T1DM患者中GADA与GAD65不同表位的结合情况，结果发现GADA与GAD65 M段和GAD65 C端同时发生反应较多，而GADA单独与GAD65 N端发生反应很少见。Towns等[4]提到了在T1DM中，GADA早期与GAD65 M段和GAD65 C端发生反应，随后与GAD65 N端发生反应。由于单克隆抗体技术在GAD65表位识别中的应用，人们发现单克隆抗体b78(GAD65 C端)、DPD(GAD65 N端)以及DPC(GAD65 M+C端)同时阳性可能与僵人综合征(stiff-person syndrome，SPS)或与尚存一定胰岛功能且易发声酮症酸中毒的T1DM有关。单克隆抗体b96.11(GAD65 M段)和DPA(GAD65 C端)同时阳性可能与病情快速进展的T1DM有关。既然GADA与GAD65表位发生反应和T1DM患者的临床特征有关，那么通过GAD疫苗是否可以抑制这种自身免疫状态呢？Skoglund等[13]比较了33例用GAD疫苗治疗以及27例用安慰剂治疗的T1DM患者，分别检测发病时和1、3、9、15个月时针对GAD65不同表位的b96.11、DPA、DPD、MICA3、b78和GAD65 N端等6个单克隆抗体，结果发现从发病到15个月针对不同表位的单克隆抗体无显著变化，单克隆抗体b78针对的GAD65 C端(GAD65-CAb)的滴度一直较低，但在SPS中其滴度较高。T1DM患者中通过疫苗治疗的患者在前3个月单克隆抗体b96.11针对的GAD65 M段(GAD65-MAb)的滴度升高，GADA的滴度也增高，3个月以后其滴度又恢复到发病时的水平。Hampe等[14]研究了100例T1DM患者的GADA滴度及GAD65表位与神经疾病的关系，结果发现在10例GADA滴度≥2000 U/mL(高滴度GADA)的T1DM患者中3例患者出现了SPS症状，且3例患者与单克隆抗体b78相关的GAD65表位发生反应的GADA滴度较高，进一步证实了在T1DM患者中，与b78(GAD65 C端)相关的GAD65表位发生反应的GADA滴度越高则发生SPS的危险越高。Chéramy等[15]则比较了高滴度GADA的7例T1DM患者、9例GAD疫苗治疗的T1DM患者、6例T1DM高危人群以及12例SPS患者的b78以及 b96.11相关的GAD65表位情况，结果发现在SPS患者中b78相关的GAD65表位(GAD65-CAb)的滴度较其他组高，而与b96.11(GAD65-MAb)相关的GAD65表位的抗体滴度在各组之间无差异，可见虽然GAD疫苗治疗的T1DM患者在前3个月b96.11针对的GAD65 M段(GAD65-MAb)的滴度会升高，但这不会增加发生SPS的风险。Ludvigsson等[16]研究了GAD疫苗治疗T1DM患者的安全性及有效性，比较了29例采用GAD疫苗治疗以及30例采用安慰剂治疗的T1DM患者，随访时间超过4年，结果发现采用GAD疫苗治疗时间>6个月的T1DM患者比相同时间安慰剂治疗的T1DM患者，在4年后C肽水平前者较后者下降慢，未发现GAD疫苗治疗的患者SPS的发生概率增高。说明GAD疫苗治疗不仅不会增加发生SPS的风险，同时对胰岛功能还具有保护作用，这可能与调节自身免疫反应有关，但还有待进一步研究证实。

3 GADA表位与LADA

3.1初诊LADA患者表位研究 LADA占T2DM的10%～15%，其早期临床表现酷似T2DM，但其胰岛β细胞遭受缓慢的免疫破坏而最终需依赖胰岛素治疗。受诊断及治疗水平的限制，该病极易被误诊为T2DM而延误治疗，GADA是将LADA从初诊T2DM中鉴别出来的重要免疫标志物。Kawasaki等[17]研究了47例日本LADA患者发现，GADA早期主要与GAD65 M段和GAD65 C端发生反应，其中与GAD65 C段发生反应占优势。伴有多个胰岛自身抗体阳性的LADA患者倾向于早期胰岛素治疗。另有研究证实，即使单独GAD65-CAb阳性的LADA患者也具有T1DM的临床特征，其胰岛功能相对较差，具有较快进展为依赖胰岛素治疗的特点[18]。Towns等[4]提到曾有研究显示，大多数日本LADA患者GADA主要与GAD65 N端反应，且倾向于较迟依赖胰岛素治疗。GAD65-CAb阳性的LADA患者其胰岛功能较差，且倾向于依赖胰岛素治疗；GAD65-NAb阳性的LADA患者占多数，其胰岛功能较好，且具有较慢依赖胰岛素治疗的特点。

3.2LADA患者随访过程中GAD65表位变化与胰岛素需要的关系 通过对1例LADA患者的随访研究发现，其GADA开始与b96.11对应的GAD65表位(GAD65 M段)结合，随后与MICA-3、MICA-4、DPC和DPA对应的GAD65表位结合，该患者胰岛功能衰竭较快，且很快依赖胰岛素治疗[19]。对242例GADA阳性的LADA患者进行了为期6年的随访研究发现，GAD65的表位随病程变化未发生明显的改变，也未发现GAD65表位变化与病情进展有明显的相关性[20]。Jin等[21]研究发现，大多数GADA与GAD65 M段和GAD65 C端同时发生反应的中国LADA患者具有低C肽水平，且更易发生自身免疫性甲状腺疾病以及倾向早期依赖胰岛素治疗等特征。Maruyama等[18]通过对119例日本LADA患者研究也未发现，LADA患者GAD65表位的变化与依赖胰岛素治疗存在明显相关。

4 小 结

自身免疫糖尿病伴有复杂的自身免疫反应，其中以T细胞介导的免疫损伤为主，B细胞分泌的胰岛自身抗体参与T细胞免疫反应。其中最常见的胰岛自身抗体为GADA。GADA表位变化与自身免疫糖尿病的发生、发展密切相关，GAD65-MAb和CAb阳性的高危人群患T1DM风险性增高。初诊T1DM的患者GADA倾向于与GAD65 M段和C端结合，而与N端罕见结合，疫苗治疗期间表位变化小。GAD65-CAb阳性的LADA患者胰岛功能较差，而GAD65-NAb阳性者症状更似T2DM，较晚需要胰岛素治疗，LADA患者GADA表位随病程延长变化较小。

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