病理性瘢痕组织内不同部位成纤维细胞的异质性

聂芳菲，张 哲(综述)，秦泽莲(审校)

(北京大学第三医院成形外科，北京 100191)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。两者的实质都是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，产生大量的胶原蛋白，使细胞外基质成分在组织中大量沉积，而难以被机体吸收或重塑的病理状态。增生性瘢痕表现为高出正常皮肤、质地较硬的皮肤纤维化疾病。瘢痕疙瘩更是瘢痕形成机制的代表性病变，是整形外科和皮肤科在临床治疗中面临的重大难题。与增生性瘢痕相比，瘢痕疙瘩的临床特点为创伤诱因不明显、增长速度过快、不易退化、向周围正常皮肤浸润扩散，并超出原皮损范围。早期常伴有炎性浸润带，手术切除后易复发，且复发范围可超过原瘢痕范围[1]。

在病理性瘢痕发病机制的基础研究中，许多研究者发现，不同层次、不同部位的瘢痕组织在临床表现、病理改变、细胞生物学和分子生物学特性等方面的差异较大，因此采取分层和(或)分部位研究，如真皮浅层和真皮深层；浸润部、增生部和老化部；中央部和周边部[2]。该文就病理性瘢痕基础研究中关于正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩不同层次、不同部位成纤维细胞的细胞及分子生物学差异作一综述，并探讨瘢痕组织内部成纤维细胞的异质性与病理性瘢痕发病机制的关系。

1 正常皮肤和增生性瘢痕组织真皮浅层、深层成纤维细胞的异质性

已有较多的研究表明正常皮肤和增生性瘢痕真皮层的成纤维细胞具有异质性。这些不同亚群的成纤维细胞在细胞形态、细胞增殖率、胶原合成、生长因子/细胞因子的产生及参与炎性反应等方面均具有明显的差异[2-5]。

Wang等[6]培养了烧伤后增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞及正常皮肤组织来源的成纤维细胞，其中将正常皮肤真皮层按照垂直深度分为五层，分别取材后培养成纤维细胞，研究结果表明，与浅层正常皮肤组织来源的成纤维细胞相比较，深层正常皮肤组织来源的成纤维细胞与增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞更相似。表现为形态较大、能够产生更多的转化生长因子β1和α平滑肌肌动蛋白；更多的胶原和较少的胶原酶；产生较多的硫酸软骨素蛋白多糖和较少的核心蛋白多糖；表达更高水平的结缔组织生长因子和热激蛋白47 mRNA；接种在胶原网架上收缩胶原的功能更强。Varkey等[7]培养下腹部正常皮肤真皮组织浅层和深层的成纤维细胞，将其种植在胶原-乙二醇氨基聚糖基质上培养4周，发现深层的真皮成纤维细胞明显使基质收缩和变硬，并降低其抗拉强度。与浅层的真皮成纤维细胞相比，深层的真皮成纤维细胞明显高表达骨桥蛋白、血管紧张素Ⅱ、过氧化物酶体增殖物激活受体α、低表达肿瘤坏死因子α、过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、蛋白聚糖、纤维调节素。总之，与浅层的真皮成纤维细胞相比较，深层的真皮成纤维细胞增殖率较低，但是能产生更多的促纤维化的细胞因子(如转化生长因子β1、结缔组织生长因子等)、高表达Ⅱ型转化生长因子β受体、Ⅰ型胶原、大分子蛋白多糖、α平滑肌肌动蛋白；而产生较少的胶原酶和小分子蛋白多糖。Honardoust等[8]提出正常皮肤组织来源的成纤维细胞具有生理功能和分子表型的异质性：浅层的真皮成纤维细胞显示了抗纤维化特性，因此局限于该层次的皮肤创伤愈合后很少形成瘢痕，表明核心蛋白多糖可导致浅层的真皮成纤维细胞中细胞凋亡标记分子的表达显著增加，凋亡和死亡的细胞增加；而深层的真皮成纤维细胞的迁移率较低，缺乏核心蛋白聚糖,抵抗核心蛋白聚糖诱导的凋亡可能是真皮深层损伤后细胞过度增殖，引起细胞外基质过度沉积，形成增生性瘢痕的原因。

上述结果均提示，正常皮肤真皮深层的成纤维细胞与增生性瘢痕成纤维细胞具有相似的表型和功能，因此可能是形成增生性瘢痕的主要细胞来源。

2 瘢痕疙瘩组织中不同层次、不同部位成纤维细胞的异质性

2.1瘢痕疙瘩真皮浅层和深层成纤维细胞的异质性 Supp等[9]培养了不同来源的细胞：正常皮肤来源的表皮细胞(normal keratinocytes，NK)、正常皮肤来源的成纤维细胞(normalfibroblasts，NFB)、瘢痕疙瘩来源的表皮细胞(keloid keratinocytes，KK)、瘢痕疙瘩浅层的成纤维细胞(superficial keloid fibroblasts，KSFB)、瘢痕疙瘩深层的成纤维细胞(deep keloid fibroblasts，KDFB)。构建组织工程皮肤，根据细胞组合的不同分成了6组：NK+NFB、NK+KDFB、NK+KSFB、KK+NFB、KK+KDFB、KK+KSFB。将构建的组织工程皮肤移植到裸鼠，进行观察和检测。结果显示，与KSFB和NFB相比，KDFB表现出Ⅰ型胶原α、转化生长因子β1、骨膜蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1和抑制素β-A的表达量增高；移植后第5组组织工程皮肤的厚度明显比对照组厚，且高表达Ⅰ型胶原α。第6组组织工程皮肤的面积明显扩大；组织学分析表明2、3、5、6组的组织工程皮肤真皮层胶原的排列异常。提示KDFB的增殖、合成能力更强，细胞活力更高；并且KDFB更倾向于向垂直方向的深层增生，而KSFB更倾向于向周围正常皮肤组织的横向扩张和浸润，KDFB和KSFB表现出不同的增殖能力和迁移方向性。

2.2瘢痕疙瘩组织内不同部位成纤维细胞的异质性 鲍卫汉[10]将临床上常见的呈浸润生长的蝴蝶样瘢痕疙瘩在外观上分为三个部分：处于边缘向外浸润正常皮肤的发红部位(浸润部)、处于中央静止状态或有老化趋向的部位(老化部)及处于前两者之间不断增生的部位(增生部)。进一步的研究表明，瘢痕疙瘩不同部位来源的成纤维细胞在增殖/凋亡调控，胶原合成功能，对某些药物的敏感性、相关基因表达等方面表现出差异。

瘢痕疙瘩浸润部、增生部与老化部的成纤维细胞呈现出不同的增殖、凋亡调控与生长特性[11]。如增殖细胞核抗原指数在瘢痕疙瘩浸润部最高，而在增生部又高于老化部和正常皮肤。瘢痕疙瘩周边部(浸润部和增生部)成纤维细胞大量分布于增殖期(G2、S、M 期)，且p53蛋白表达较低；而瘢痕疙瘩中央部(老化部)成纤维细胞p53蛋白呈强表达，且主要分布在静止期(G1、G0期)。采用低血清体外培养成纤维细胞，瘢痕疙瘩增生部的成纤维细胞生长快；浸润部、老化部成纤维细胞及正常皮肤的成纤维细胞受到明显抑制。研究还表明，浸润及增生部的成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原的功能比老化部成纤维细胞旺盛；也更易于受干扰素α-2b的抑制。

Seifert等[12]采用人类全基因组芯片研究了瘢痕疙瘩中心部位深层、瘢痕疙瘩中心部位浅层(趋向萎缩和不活跃，更加类似于扁平瘢痕，与老化部相应)、活跃的红色的瘢痕疙瘩边缘部浅层与NFB比较基因表达的差异，发现凋亡抑制基因(细胞死亡调节蛋白)在活跃的瘢痕疙瘩边缘部成纤维细胞上调，而凋亡诱导基因(解整合素样金属蛋白酶12、细胞周期及凋亡调节蛋白1、膜联蛋白A1)以及诱导细胞外基质降解的基因(如基质金属蛋白酶19)在老化部位成纤维细胞上调。此外，瘢痕疙瘩中碱性成纤维细胞生长因子及其受体Flg、血小板源生长因子A及其受体血小板源生长因子受体α、血管内皮生长因子等血管生成因子的表达在老化部、增生部和浸润部依次递增[13]；免疫组织化学法检测瘢痕疙瘩组织，表明瘢痕疙瘩中周围部胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子1受体、细胞周期素D1的表达显著高于中央部[14-15]。

Iqbal等[16]还证实了瘢痕疙瘩不同部位来源的成纤维细胞的分子表型存在异质性，他们将瘢痕疙瘩组织分为病损浅层、病损中间部、病损边缘部，分别取材，酶消化法分离成纤维细胞，用流式细胞分析仪分析了其原代和第一代细胞的表面标记。结果发现，瘢痕疙瘩含有不同的间充质样干细胞亚群：与正常皮肤相比，表达CD13、CD29、CD44、CD90阳性(代表间充质干细胞的表面标记分子)的细胞在病损浅层和中心部分明显增高；在正常皮肤，则以表达CD34、CD90、CD117阳性(代表造血干细胞的标记分子)的细胞为主；高表达血管细胞黏附分子1、骨形态发生蛋白受体2、肌节同源盒基因同系物2的细胞仅存在于瘢痕疙瘩边缘部。而体外培养的第一代成纤维细胞中许多间充质干细胞的标记分子逐渐减少，所有的造血干细胞表面标记已丧失。

3 病理性瘢痕组织内不同部位细胞外基质组成、微血管分布的差异

除了成纤维细胞的异质性，正常皮肤及瘢痕组织中的细胞外基质分布也存在着异质性。研究表明，真皮深层Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例高于真皮浅层，Ⅻ型胶原在毛囊根鞘周围、真皮浅层、真皮深层的表达量依次递减，型胶原在真皮深层、毛囊、真皮浅层的表达量依次递减[3]。与真皮浅层相比，瘢痕疙瘩真皮深层组织的胶原排列方向更具有随机性，胶原纤维束更厚[17]。

Kurokawa等[18]研究了瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织中血管密度及组织形态学改变。结果表明，瘢痕疙瘩中的血管密度不及增生性瘢痕，且瘢痕疙瘩中的血管腔较扁平。与周边部相比，瘢痕疙瘩中央部的毛细血管更扁平。利用连续组织切片构建的微血管三维图提示瘢痕疙瘩内的微血管无沟通，瘢痕疙瘩组织内血液供应不足。国内学者在对瘢痕疙瘩三个部位(老化部、增生部和浸润部)的组织形态及超微结构观察中发现，老化部的微血管虽然呈增生状态但绝大多数微血管呈完全闭塞及部分闭塞状态[10]。

4 成纤维细胞的异质性与病理性瘢痕发病机制的相关性

4.1真皮浅层和真皮深层成纤维细胞的异质性与病理性瘢痕发病机制的相关性 增生性瘢痕往往是由创伤后造成局部皮肤表皮和真皮浅层缺失所致，研究报道真皮深层的成纤维细胞可能是形成增生性瘢痕的主要细胞来源[6]。由于深层成纤维细胞增殖能力强而迁移能力较差，且更倾向于向垂直方向的深层增生，因此增生性瘢痕病损往往局限在受伤伤口界限以内，表现为增生的组织在垂直于皮面的方向过度增生，而不浸润到周围正常皮肤组织[8-9]。瘢痕疙瘩常常无明显的创伤因素而发生、发展，其发病机制中可能包含了浅层和深层两个层次成纤维细胞的作用。由于深层成纤维细胞具有较强的增殖、胶原合成能力，同时浅层成纤维细胞具有较强的向水平方向迁移、浸润和扩张的能力，瘢痕疙瘩中增生的组织不仅在垂直于皮面的方向过度增生，而且侵蚀周围的组织结构，在水平方向浸润正常皮肤[9]。

4.2瘢痕疙瘩内不同部位成纤维细胞的异质性与瘢痕疙瘩发病机制的相关性 瘢痕疙瘩增生部和浸润部的成纤维细胞表现出相对更强的增殖能力、胶原合成能力和对某些药物的敏感性，并显示出与这些能力相应的基因水平的改变。对不同部位细胞表型的鉴定提示瘢痕疙瘩中的成纤维细胞可能是多种细胞的混合体。这其中包括了不同来源的间充质干细胞、表皮干细胞等细胞亚群。因此，瘢痕疙瘩的不同部位表现出不同的浸润和增殖特性。当然，除细胞本身的遗传特性外，其很可能与不同部位微血管的状态、细胞外基质的分布、炎症因素等局部微环境的诱导作用有关。因此，研究成纤维细胞的功能特性不能脱离细胞所处的微环境因素[19]。瘢痕疙瘩中可能存在诱导并适合若干群不同表型的成纤维细胞生存的微环境，从而能够不断增生和浸润，表现为持续修复的创伤愈合过程。

5 展 望

在涉及病理性瘢痕组织内不同部位异质性的基础研究中，成纤维细胞无疑是最重要，也是研究得最多的细胞[20]。病理性瘢痕组织内不同层次和不同部位的成纤维细胞在细胞形态、增殖/凋亡调控、迁移能力和方向性、胶原合成的类型和数量、细胞因子的产生、表面抗原、基因表达、对某些药物的敏感性等方面均表现出异质性。有学者曾指出，就同一解剖部位的成纤维细胞而言，至少可以分成三个亚群：真皮浅层(乳头层)、真皮深层(网织层)、毛囊相关的成纤维细胞，分别处于不同的微环境中，发挥不同的生理功能；已证实瘢痕疙瘩发生中表皮细胞和成纤维细胞两种细胞是相互影响、相互作用的[3]。此外，研究还表明，不同解剖部位来源的成纤维细胞在基因表达方面存在差异，表达不同的同源核转录因子，表现出不同的转录模式；在细胞外基质合成、脂质代谢以及调控细胞增殖和迁移的细胞信号转导通路等基因的表达上差异显著[21-22]。已有的相关研究均提示，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的临床特点及其差异与不同深度、瘢痕组织内部不同部位、不同解剖部位成纤维细胞亚群的异质性及其所处的微环境有关。进一步研究真皮层成纤维细胞的异质性及其所处的微环境对其影响，将有助于更深刻地阐明病理性瘢痕的发病机制。

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