降钙素基因相关肽经鼻给药进入中枢神经系统及促脑梗死修复的实验性研究

吴庆建，闫承军，宋大庆，刘云海，孙树印

（济宁市第一人民医院急诊内科，山东济宁272011）

降钙素基因相关肽经鼻给药进入中枢神经系统及促脑梗死修复的实验性研究

吴庆建，闫承军，宋大庆，刘云海，孙树印

（济宁市第一人民医院急诊内科，山东济宁272011）

目的寻找快速、便捷有效的靶向中枢给药方法，为脑梗死治疗提供新的思路。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）脑缺血再灌注模型，采用ELISA法测定经鼻（IN）和静脉（IV）注射CGRP后30 min时，各脑区的CGRP浓度，并观察IN和IV给予CGRP对局灶性脑梗死的治疗效果。结果IN给药组脑部各区域、颈髓和脑脊液（Cerebro－spinal fluid，CSF）中CGRP浓度较IV组显著增高（P＜0.01），与IV组相比较，IN给药组梗死体积减小，脑血流量增加（P＜0.01）。结论CGRP经鼻靶向中枢给药可以避开血脑屏障阻碍，并对大鼠局灶性脑梗死有预防和保护作用。

降钙素基因相关肽；经鼻；脑梗死；神经保护药；中枢神经系统

血脑屏障（BBB）是保护中枢神经系统的重要结构，由脑部微血管系统的毛细血管内皮、基底膜、内皮间紧密连接、角质细胞突起、足细胞所组成，阻挡有毒有害物质向脑部转运，保障中枢神经系统的正常功能。其结构特点决定了大分子药物，如重组蛋白、基因治疗相关药物、多肽、单克隆抗体等都无法从血液循环穿越血脑屏障进入中枢神经系统［1］，高达95%的药物静脉给予时，被BBB阻挡住。Liu等［2］研究表明降钙素基因相关肽（Calcitonin generelated peptide，CGRP）对局灶性脑梗死后脑损伤起到保护作用，但CGRP的相对分子量为3 786.91，其大分子特性，使其经外周给药，如经静脉或肌肉注射无法透过血脑屏障到达中枢神经系统。国外学者曾报导脑池内应用CGRP［3，4］，但由于可能发生致命性副作用，脑池注射不能成为临床的常规用药途径。如何使CGRP通过临床易于应用的途径绕过血脑屏障的阻碍，更有效地进入脑脊液和脑组织，是神经病学研究领域学者面临的重要挑战之一。

经鼻给药是一种非侵入性的中枢给药方式，其安全、便捷、靶向性强，药物可以较快在脑部达到治疗浓度且可避免全身用药可能带来的副作用［5，6］。本研究试图对比IN和IV给予CGRP在脑部的分布情况，探讨CGRP经鼻靶向中枢的可行性，并观察IN和IV CGRP对大鼠局灶性脑梗死的疗效。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 山东鲁抗动物实验中心提供健康雄性SD大鼠32只（许可证号：SCXK鲁20050017），体重230～300 g，随机分为正常对照组、IN CGRP组、IV CGRP组和IN媒介液对照组，每组8只。

1.2 实验试剂与仪器 大鼠CGRP ELISA检测试剂盒（武汉中美科技有限公司；大鼠CGRP（1 mg，购自美国Sigma公司，批号：015－09）；PBS粉剂（北京中杉生物技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。电子分析天平（上海天平仪器厂，JA－31001型）；高速低温离心机（美国Sigma公司，3K30型）；切片床（德国LEICA CM 1900型）；激光多普勒血流量测量仪（瑞典，PeriFlux System PF5001型）；微量注射器（无锡市东风玻璃仪器厂，320222YHBA 01型）。

1.3 大鼠皮层梗死区周围缺血半暗带脑血流量的监测 各组动物分别于再灌注后24 h，麻醉动物，立体定位仪固定头部，常规消毒，头正中切口，逐层分离，暴露完整的颅骨，取头部中线旁2 mm，冠状缝前1 mm处钻开一骨窗至硬脑膜，激光多普勒血流量测量仪测定皮层脑血流量。

1.4 MCAO脑缺血再灌注模型的制作 参照吴远华等［7］的改良线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的制作方法，3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取颈前皮肤正中切口，分离左侧颈总（CCA）、颈外（ECA）、颈内动脉（ICA），缝合线暂时阻断CCA和ICA血流，将预先准备好的栓线插入ICA直至阻断大脑中动脉（MCA）起始端，尼龙线插入的深度19～22 mm。大脑中动脉阻断后60 min，将尼龙线轻轻退至CCA予以再灌注。手术过程中采用肛表电热毯反馈装置将大鼠体温维持在37℃。

1.5 经鼻给药方法 大鼠麻醉状态下，取仰卧位，颈背部垫高以有利于药物进入后鼻腔。各组与再灌流后，经鼻腔插入与微量注射器相连的硅胶管，分别给予CGRP 1μg（溶于50μL媒介液中）。两侧鼻孔交替给药，单次给药量为5μL，间隔时间2 min，每只大鼠给予10次，20 min内给予总量为50μL的药液。

1.6 ELISA检测各脑区CGRP浓度 经鼻给药结束后30 min，过量麻醉处死大鼠后，取完脑脊液后，断头取脑，分别取嗅球、脑桥、颈髓、皮质、海马，电子天平称重后置于－85℃低温冰箱中备用。按W∶V（g∶mL）＝1∶20的比例加入PBS缓冲液进行组织匀浆，将组织匀浆液15 000 rpm离心30 min，完毕后取上清液。ELISA测定方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 红四氯氮唑（TTC）染色测定脑梗死体积 4只大鼠行脑血流量检测后，过量麻醉后断头处死，迅速取出脑组织，冰生理盐水冲洗表面血迹，－20℃冰冻脑组织10 min，将脑放置于切片床上，在视交叉处开始，切成厚度约2 mm的冠状脑切片，共6个层面，立即置于2%TTC溶液中，37℃恒温孵育避光染色20 min，染色后放入4%多聚甲醛溶液中固定6 h。采用计算机病理图像采集系统，6个层面的梗死面积之和×2 mm即为脑梗死体积（MV），并计算左右半球体积（LV、RV）。为纠正脑水肿对脑梗死体积的影响，采用Swanson等［8］应用的以下公式计算梗死体积：梗死体积（%）＝［LV－（RV－MV）］／LV ×100%。

2 结果

2.1 CGRP在中枢神经系统的定量分析 表1显示了IN或IV CGRP在中枢神经系统各部位及脑脊液中的浓度分布。IN给药组脑部各分区、脑脊液及颈髓中的CGRP浓度要高于IV给药组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.2 CGRP经鼻给药对脑梗死体积的影响 脑缺血再灌注24 h后，IN－CGRP组脑梗死体积为26% ±12%，IN媒介液组脑梗死体积为48%±9%，即IN－CGRP治疗能够显著减轻44%的脑梗死体积（P＜0.01），IV CGRP组的脑梗死体积为41%±9%，与IN CGRP组比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01），经鼻给药组较经静脉给药组脑梗死体积显著降低。

表1 不同途径给予CGRP后各脑区CGRP浓度（pg·g－1）

2.3 大鼠缺血半暗带局部脑血流量（rCBF）的变化

制作模型后，模型组rCBF均明显降低，与正常对照组相比较具有显著差异（P＜0.01）。24 h后，从表2可以看出，IN CGRP组脑血流显著多于IV CGRP组，具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 CGRP经鼻给药对rCBF的影响（±s，n＝8）

表2 CGRP经鼻给药对rCBF的影响（±s，n＝8）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与IN CGRP组比较，bP＜0.01；与IV CGRP组比较，cP＜0.01

＜0.01组别93.1±2.6 IN CGRP组 70.1±4.3aIV CGRP组 60.5±3.7abIN媒介液组 49.3±1.2abcF 412.13 P rCBF正常对照组

3 讨论

由于BBB的存在，蛋白多肽和基因药物难以到达中枢神经系统达到有效的治疗浓度，而脑室注射、延髓等创伤风险较大的给药方式，再加上手术的创伤、功能损伤和感染等不良并发症，在临床治疗中难以成为常规的给药途径。近年来许多学者研究证明，许多药物（如）经鼻给药可绕过BBB的阻碍，进入中枢神经系统，中枢靶向性强，且具有无创、给药量少、生物利用度高、无肝脏首过效应、吸收快等优点［9］。因此，经鼻靶向中枢给药途径受到越来越多神经科学领域学者的关注。

本研究结果表明，经鼻靶向中枢给予CGRP可迅速到达中枢神经系统各区域，且经鼻给药途径在脑部各区、颈髓、脑脊液中的CGRP浓度显著高于静脉给药组，差异具有统计学意义。由此可见，鼻腔和脑之间存在着可避开BBB的快速的给药通路。鼻腔根据功能可分为鼻前区、嗅区和呼吸区，嗅觉区分布着嗅细胞，其中枢突形成无髓的嗅神经纤维，向上穿行在黏膜下层形成嗅丝，穿过筛孔与嗅球相连［10］。当药物如CGRP鼻腔给药后便可以通过嗅神经通路被递送至中枢神经系统，如脑脊液、颈髓、大脑、脑干、小脑等部位，发挥治疗作用。

迄今研究证明，CGRP是舒张血管作用最强的内源性活性多肽，体外实验研究证明CGRP可拮抗内皮素引起的血管收缩，且作用时间持久［11］。众多临床研究发现，脑梗死早期，体内CGRP和内皮素平衡失调，CGRP显著降低，内源性CGRP耗竭加重了脑缺血及脑损害，不利于神经细胞功能恢复［12］。提示若给予外源性CGRP，在脑损伤区或中枢神经系统形成较高浓度，可大大提高CGRP对脑损伤的保护效应。本研究结果证实，大鼠局灶性脑缺血后，经鼻给予CGRP可显著减少脑梗死体积高达44%，且有效增加缺血半暗带的血流量。而经静脉给予同剂量的CGRP未能显示出对脑梗死的明确治疗效果，表明CGRP经静脉给药不能避开BBB的阻断，进入中枢神经系统发挥神经保护作用。

由此可见，CGRP经鼻靶向中枢给药的方法具有安全、无损伤、快速、靶向性强的特点，可以较快在脑部达到治疗浓度且可避免全身用药可能带来的副作用。因此，CGRP经鼻靶向中枢给药可能成为一条有效的治疗脑缺血损伤或其他中枢神经系统疾病的新途径，其确切的转运机制尚有待进一步阐明。

综上所述，本研究结果提示，CGRP经鼻给药脑梗死大鼠后，能够修复脑梗死组织的损伤，这为CGRP治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路。

［1］ Omidi Y，Barar J.Impacts of blood－brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors［J］.Bioimpacts，2012，2（1）：5－22.

［2］Liu Z，Liu Q，Cai H，et al.Calcitonin gene－related peptide prevents blood－brain barrier injury and brain edema induced by focal cerebral ischemia reperfusion［J］.Regul Pept，2011，171（1－3）：19－25.

［3］Locatelli M.The importance of substance P and calcitonin gene related peptide as vasodilator neuropeptide during acute phase of experimental posthemorrhagic vasospasm［J］.JNeurosurg Sci，2000，44（4）：186－191.

［4］Imaizumi S，Shimizu H，Ahmad I，etal.Effectof calcitonin gene－related peptide on delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage in rabbits［J］.Surg Neurol，1996，46（3）：263－270.

［5］Nakayama T，llloh K，Ruetzler C，etal.Intranasal administration of E－selectin to induce immunological tolerization can suppress subarachnoid hemorrhage－induced vasospasm implicating immune and inflammatorymechanismsin its genesis［J］.Brain Res，2007，1132（1）：177－184.

［6］ Banks WA.The central nervous system as a target for peptides and peptide－based drugs［J］.Expert Opin Drug Deliv，2006，3（6）：707－712.

［7］ 吴远华，朱广旗，胡蓉，等.线栓法大鼠脑缺血再灌注模型改良与评价［J］.中国实用神经疾病杂志，2010，13（18）：4－6.

［8］Swanson RA，Morton MT，Tsao－Wu G，et al.A semiautomated method formeasuring brain infarct volume［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1990，10（2）：290－293.

［9］ 曹迪.脑靶向给药的研究进展［J］.中国医药指南，2012，10（18）：65－67.

［10］王鹏，肖学凤.经鼻脑靶向递药系统的研究进展［J］.现代药物与临床，2013，28（1）：96－100.

［11］Cheung RT，Cechetto DF.Neuropeptide Y－Y1 receptor antisense oligodeoxynucleotide increases the infarct volume after middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Neuroscience，2000，98（4）：771－777.

［12］周志梅，仲玉洁.脑梗死患者血浆神经肽Y、降钙素基因相关肽变化的临床研究［J］.中国现代医生，2012，50（13）：48－49，52.

The experimental study of calcitonin gene－related peptide intranasal adm inistration to central nervous system and prompt the repair of cerebral infarct

WU Qing-jian，YAN Cheng-jun，SONG Da-qing，LIU Yun-hai，SUN Shu-yin
（Department of Emergency，Jining No.1 People′s Hospital，Jining 272011，China）

ObjectiveTo develop a convenientand effectivemethod for delivering CGRP to the central nervous system bypassing the blood－brain barrier（BBB），and to explore whether it had preventive and protective effects on cerebral infarction in rats.MethodsThe MCAOmodelwasmade by nylon strand.CGRP concentration wasmeasured IN and IV injection of CGRP after30min in differentbrain areas using enzyme－linked immunosorbentassay（ELISA），and explored the treatment IN and IV CGRP in ratswith focal cerebral infarction.ResultsCGRP demonstrated amuch higher delivery of IN than IV CGRP to the brain regions.Intranasal administration CGRP had significant preventive and protective effect to focal cerebral infarction which showed the brain infarction decreased and cerebral blood flow increased（P＜0.01）.ConclusionCGRP intranasal administration targeting central administration can avoid the blood－brain barrier block，and had preventive and protective effects on the rats with focal cerebral infarction.Intranasal administration CGRP had definite preventive and protective effect to focal cerebral infarction in rats.

Calcitonin gene related peptide；Intranasal administration；Cerebral infarction；Neuroprotective agents；Central nervous system

R965

A

2095－5375（2014）08－0441－004

2010年济宁市科技局立项课题（No.济科字［2010］85号－24）

吴庆建，男，研究方向：脑血管危重症救治，E－mail：wqw110＠163.com

孙树印，男，主任医师，研究生导师，研究方向：内科危重症救治，Tel：0537－2256996，E－mail：13615372866＠163.com