异烟酸－吡唑啉酮比色法测定咖啡因中残留氰化物

杜传强，聂 磊

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东新华制药股份有限公司，山东淄博255000）

异烟酸－吡唑啉酮比色法测定咖啡因中残留氰化物

杜传强1，2，聂 磊1

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东新华制药股份有限公司，山东淄博255000）

目的采用异烟酸－吡唑啉酮比色法测定咖啡因中残留氰化物。方法在中性条件下，氰化物与氯胺T反应生成氯化氰，再与异烟酸作用，经水解后生成戊烯二醛，最后与吡唑啉酮缩合生成蓝色染料，在638 nm处的吸光度与氰化物含量成正比。结果氰化物浓度在0.007 74～0.193 44μg·mL－1范围内具有良好的线性，相关系数r＝0.999 97，平均回收率为100.2%（RSD＝0.49%，n＝9）。结论该方法灵敏、准确，适用于咖啡因中氰化物的测定。

异烟酸－吡唑啉酮比色法；咖啡因；氰化物

氰化物具有很强的毒性，其毒性跟CN－对重金属离子的超强络合能力有关，CN－主要跟细胞色素P450中的金属离子结合，从而使其失去在呼吸链中起到的传递电子能力，进而使中毒者死亡。然而，氰化物在有机合成中是非常有用的试剂，常用来在分子中引入一个氰基，生成有机氰化物，咖啡因合成工艺中就用到氰化钠引入氰基，因此CN－有可能在咖啡因原料药中残存。考虑到氰化物的毒性，需要开发准确、可靠的分析方法用于检测成品咖啡因中的残留氰化物含量，以确保咖啡因中残留的氰化物不会对人体产生危害。我们采用异烟酸－吡唑啉酮比色法［1～7］测定咖啡因中残留的氰化物含量，通过对该分析方法的专属性、精密度、线性、范围、准确度及耐受性进行验证［8］，说明该方法适用于咖啡因中氰化物的测定。

1 仪器和试药

1.1 仪器 岛津UV2450紫外分光光度计，Mettler AE240电子天平。

1.2 试药

1.2.1 磷酸盐缓冲液 称取34.0 g无水KH2PO4和35.5 g无水Na2HPO4于一烧杯中，加水溶解。用2%NaOH溶液调节pH＝7（电位法），用水稀释至1 000 mL，摇匀放入冰箱。

1.2.2 1%（m／V）氯胺T溶液：临用前，称取0.5 g氯胺T，加水溶解并稀释至50mL，摇匀，储存于一棕色瓶中。

1.2.3 异烟酸－吡唑啉酮溶液 称取1.5 g异烟酸，用24 mL 2%NaOH溶液溶解，加水稀释至100 mL，摇匀，于棕色瓶中避光保存。称取0.25 g吡唑啉酮，加入20 mL N，N－二甲基甲酰胺溶解，于棕色瓶中避光保存，临用前，将异烟酸溶液和吡唑啉酮溶液以5∶1混合。

1.2.4 氰化钾标准液（1 mL约含1.00μg氰离子）。

2 线性方程测定

取氰化钾标准液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于8个25 mL容量瓶中，分别加入0.1%氢氧化钠溶液至10 mL，再分别加入5 mL磷酸盐缓冲液，混匀。迅速加入0.2 mL 1%氯胺T溶液，立即盖塞，混匀，放置3～5 min。向各管中加入5 mL异烟酸－吡唑啉酮溶液，混匀，加水稀释至刻线，摇匀，在25～35℃的水浴中放置40 min。用分光光度计在638 nm波长处，未加入氰化钾标准液瓶做空白，测量吸光度，并以测定的吸光度为纵坐标，以氰离子浓度为横坐标做线性方程。

3 样品的测定方法

精确称量10 g咖啡因，于一150 mL锥形瓶中。加入30 mL 0.1%氢氧化钠溶液振摇10 min。过滤到50 mL容量瓶中，用少量0.1%氢氧化钠溶液洗涤数次，并稀释至刻度。取2个25 mL容量瓶，其中一瓶加入咖啡因溶液5 mL，然后向两瓶中加入0.1%氢氧化钠溶液5 mL，再向两瓶中分别加入5 mL磷酸盐缓冲液，混匀，迅速加入0.2 mL 1%氯胺T溶液，立即盖塞，混匀，放置3～5 min。向各瓶中加入5 mL异烟酸－吡唑啉酮溶液，混匀，加水稀释至刻度，摇匀，在25～35℃的水浴中放置40 min。用分光光度计在638 nm波长处，未加样品瓶做空白，测量吸光度。咖啡因中氰化物的含量按下式计算：

式中A为测量样品的吸光度，a，b和c分别为回归方程截距，回归方程斜率及每克咖啡因中含有的氰化物（CN－，μg）。

4 方法验证

4.1 专属性 称量10 g咖啡因，照“3”项下操作得咖啡因溶液。取7个25 mL容量瓶，分别加入氰化钾标准溶液0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0 mL，后3个容量瓶各加入5 mL咖啡因溶液，然后照“3”项下操作，测量吸光度分别为0.150、0.150、0.149、0.150、0.150、0.150，由此证明加入咖啡因对吸光度无影响，专属性符合要求。

4.2 精密度

4.2.1 重复性 取10个25 mL容量瓶，分别加入氰化钾标准溶液0、1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0 mL，然后各瓶加入0.1%氢氧化钠溶液至10 mL。再照“3”项下操作，测量吸光度，计算吸光度与浓度比值（A／C）的相对标准偏差（RSD）＝0.24%＜2.0%，重复性符合要求。

4.2.2 中间精密度 同一个实验室内，不同分析人员，不同时间，操作方法同“4.2.1”项下，A／C的RSD＝0.29%＜2.0%，中间精密度符合要求。

4.3 线性及范围 取8个25 mL容量瓶，分别加入氰化钾标准溶液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，然后各瓶加入0.1%氢氧化钠溶液至10 mL。再照“3”项下操作，测量吸光度，利用ORIGIN 5.0软件，以吸光度对氰离子浓度（μg·mL－1）做线性方程：A＝0.000 860 215＋3.831 05C（r＝0.999 97），氰离子浓度在0.007 74～0.193 44μg·mL－1范围内具有良好的线性。

4.4 检测限与定量限 依据校正曲线，吸收度的标准偏差SD＝0.002 31，校正曲线斜率S＝3.831 05计算得到检测限（LOD）＝3.3×SD／S＝0.001 99μg ·mL－1；定量限（LOQ）＝10×SD／S＝0.006 03μg ·mL－1。

4.5 回收率 取10个25 mL容量瓶，分别加入氰化钾标准溶液0、1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0 mL，然后各瓶加入0.1%氢氧化钠溶液至10 mL。再照“3”项下操作，测量吸光度，依据线性方程求出氰离子的测量浓度，与加入氰离子的浓度相比即为回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

4.6 耐受性 取2个25 mL容量瓶，分别加入氰化钾标准液0、1.0 mL，然后各瓶加入0.1%氢氧化钠溶液至10 mL。再照“3”项下操作，显色完毕，分别测量放置0、10、20 min时的吸收度，无差异，说明显色完毕放置适当时间测量，不影响测定结果，耐受性符合要求。

5 咖啡因样品测定

取5个连续批次的咖啡因，照“3”项下操作，测定结果见表2。

表2 咖啡因中残留氰化物的测定

5个连续批次的咖啡因均未检出氰化物，说明咖啡因中不含有氰化物。

6 结论

用异烟酸－吡唑啉酮比色法测定咖啡因中残留氰化物含量，不受样品干扰，回收率高，重现性好，测定结果准确可靠，该法适用于咖啡因中残留氰化物的测定。同时为其他产品中氰化物含量测定提供参考。

［1］ 国家环境保护局.水质氰化物的测定第二部分：氰化物的测定［S］.GB／T 7487－1987，1987.

［2］ 郭东华，刘贤文，王春生，等.异烟酸－吡唑啉酮分光光度法测定硫氰酸根用于油水井间示踪［J］.油田化学，2007，24（4）：304－306.

［3］ 冯翠霞，林丽玲，黄辉涛.分光光度法测定尿中硫氰酸盐的异烟酸－吡唑酮［J］.中国职业医学，2009，36（6）：501，504.

［4］ 金爱武.唾液中硫氰酸盐的吡啶－巴比妥酸分光光度测定方法［J］.劳动医学，1999，16（3）：176.

［5］ 腾根发，虞雄华.牛奶中硫氰酸盐的测定［EB／OL］.2011－3－28.http：／／www.sepu.net／down／showdown.asp？id＝2199.

［6］ 李卫群，单胜艳，朱慧.分光光度法测定乳与乳制品中硫氰酸钠的含量［J］.中国食品添加剂，2010，（3）：240－243.

［7］ 伍金娥，常超，胡海琼，等.紫外分光光度法测定掺假牛奶中的硫氰酸钠含量［J］.武汉工业学院学报，2010，29（2）：1－3.

［8］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录194－195.

Determ ination of cyanide in caffeine by isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod

DU Chuan-qiang1，2，NIE Lei1
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Shandong Xinhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

ObjectiveUsing isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod for the content determination of CN－in Caffeine.MethodsIn neutralmedium，the cyanide reacted with chloramine T to form cyanogen chloride.Cyanogen chloride reacted with isonicotinic acid and then hydrolyzed to form glutaconaldehyde which reacted with pyrazolone to form blue dye.The cyanide content had positive correlation with absorbance of the blue dye at 638 nm.ResultsThe range of linear relationship of cyanide was 0.007 74～0.193 44μg·mL－1（r＝0.999 97）.The average recovery was 100.2%（n＝9）；The relative standard deviation was0.49%.ConclusionThemethod was sensitive and accurate，which was suitable for the determination of cyanide in caffeine.

Isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod；Caffeine；Cyanide

R927.1

A

2095－5375（2014）08－0454－003

杜传强，男，研究方向：药物分析，E－mail：164380065＠qq.com

聂磊，男，博士研究生，副教授，研究方向：中药质量评价，Tel：0531－88382330，E－mail：nielei2004＠sdu.edu.cn