枸杞多糖对自身免疫性卵巢早衰模型小鼠的保护作用

黄 恬，郑晓霞，邱小华，王 艳

（汕头大学医学院第二附属医院，广东汕头515041）

枸杞多糖对自身免疫性卵巢早衰模型小鼠的保护作用

黄 恬，郑晓霞，邱小华，王 艳

（汕头大学医学院第二附属医院，广东汕头515041）

目的探讨枸杞多糖对自身免疫性卵巢早衰小鼠的保护作用。方法以小鼠免疫性卵巢早衰模型模拟卵巢早衰，研究枸杞多糖对小鼠免疫性卵巢早衰模型动情周期、体重、血清抗透明带抗体、血卵泡刺激素（FSH）及雌二醇（E2）浓度的影响。结果与模型组比较，枸杞多糖治疗组能改善了小鼠的性周期紊乱，降低血清抗透明带抗体、FSH的浓度，提高血清E2的浓度，并在第7周至第8周时增加体重。结论枸杞多糖对自身免疫性卵巢早衰具有保护作用。

枸杞多糖；卵巢早衰；小鼠

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或医源性损伤导致的卵巢功能衰竭，以雌激素（E2）降低伴有卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）升高为特征［1］。POF的发病率为1%～3%，占继发性闭经的10%～20%［2～4］，由于病因不明，治疗颇为棘手，尚无有效措施。POF具有肾虚血亏血瘀的病机特点［5］，因此补肾、养血、活血成为治疗该病的关键［6］。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是从宁夏特色植物枸杞（Lycium bararum）中分离出的主要多糖之一，具有养阴补血、滋补肝肾、益精明目之功效，故可能对自身免疫性POF具有治疗作用。本研究拟通过小鼠免疫性卵巢早衰模型，观察LBP对卵巢早衰治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL小鼠，雌性，15～18 g，72只，由南方医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（粤）2006－0015。

1.2 实验仪器与材料 Model 680酶标仪（Bio－Rad公司）；Pzp3：小鼠透明带3（ZP3）的多肽片段，为ZP3的第330－342个氨基酸，其氨基酸序列为：Asn－Ser－Ser－Ser－Ser－Gln－phe－Gln－Ile－His－Gly－pro－Arg（杭州中肽生物有限公司，批号：CC－11－030）。弗氏完全佐剂（Sigma公司，批号：038K8726）；弗氏不完全佐剂（Sigma公司，批号：086K8905）。兔抗小鼠Azpab抗体ELISA试剂盒（美国ADL公司）。小鼠血卵泡刺激素及雌二醇水平ELISA试剂盒（美国DRG公司）；枸杞多糖（上海源叶生物科技有限公司，批号：91087，纯度＞98%）；醋酸泼尼松片（广东三才石岐制药有限公司，批号：200703116）。

2 实验方法

2.1 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立［7］C57BL小鼠72只，随机分为空白对照组12只和造模组60只。称取1 mg的Pzp3粉末，加入三蒸水配成0.2 mg·mL－1的Pzp3溶液。造模组按文献方法，以Pzp3溶液在足底及腹部皮肤皮下多点注射，每2周1次，共注射3次，第1次加入等量弗氏完全佐剂，第2次和第3次加入等量弗氏不完全佐剂以制备免疫性POF动物模型，空白对照组同时给予相同体积生理盐水。

2.2 动物分组 造模之日起，每天下午3点阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期的变化。将造模组随机分为模型组、LBP高、中、低剂量组（60、30、15 mg ·kg－1）、泼尼松阳性对照组（4 mg·kg－1），每组12只。各给药组于第三次免疫后，按10 mL·kg－1灌胃给药，空白对照组和模型组给予相同体积生理盐水，共连续给药4周，每周称重1次。

2.3 阴道脱落细胞检测 每天下午3点取各组小鼠做阴道脱落细胞涂片。以生理盐水润湿棉签，取阴道脱落细胞涂于载玻片，自然干燥，甲醇固定1 h，室温自然干燥，Giemsa染色20 min，0.01 mol·L－1PBS冲洗3次，光学显微镜观察其动情周期变化。

2.4 ELISA法检测小鼠血清AzpAb、FSH及E2浓度 最后一次给药后，小鼠摘眼球取血，离心后取上清液，按ELISA法检测外周血中AzpAb、FSH和E2浓度。从4℃冰箱拿出试剂盒，室温下平衡1 h。从－20℃冰箱拿出样本，置于4℃解冻。按照100 μL／孔依次加入标准品（AzpAb浓度为0、5、10、25、50、100 pg·mL－1，FSH浓度为0、5、10、25、50、100 m IU·mL－1，E2浓度为0、8、24、80、160、320 m IU· mL－1，每个浓度做2个重复对照）、待测血清样品，设4个空白对照孔（不加样品，加0.01 mol·L－1PBS液）。加入50μL酶标抗体，轻轻晃动15 s，37℃孵育1 h。弃上清液，300μL／孔依次加入洗涤液，静置30 s，弃洗涤液，滤纸上扣板清除洗涤余液，重复洗涤5次。每孔加底物溶液100μL显色（A与B 1∶1混合），轻轻晃匀5 s，37℃孵育15 min。每孔加终止液50μL，轻轻晃动30 s，以空白孔校零，30 min内于酶标仪450 nm处测定OD值。

2.5 统计学方法 实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析，各组的实验数据以±s表示，多组间多重比较采用ANOVA分析；两样本率的比较采用卡方检验进行统计学分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 LBP对小鼠免疫性卵巢早衰模型的性周期的改变的影响 对照组有83%（10／12）小鼠仍维持正常的性周期，而模型组仅有25%（3／12）小鼠性周期无明显变化，各治疗组比模型组情况有所好转，分别为：小剂量治疗组41%（5／12）、中剂量治疗组58%（7／12）、大剂量治疗组75%（9／12）、泼尼松阳性对照组75%（9／12）小鼠性周期无明显改变。比较各组小鼠性周期紊乱比例，模型组与空白对照组之间差异显著（P＜0.01），说明模型组小鼠总体的性周期发生紊乱。各治疗组与模型组之间差异显著，P＜0.01，提示各治疗组改善小鼠的性周期紊乱（见表1）。

表1 对小鼠免疫性卵巢早衰模型的性周期的改变的影响（单位：只）

3.2 LBP对小鼠免疫性卵巢早衰模型的体重改变的影响 实验结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠在第3周至第8周的体重有显著性降低体重（P＜0.05）；各给药组小鼠在第3周至第6周的体重有显著性降低体重（P＜0.05）。与模型组比较，LBP各给药组及波尼松阳性对照组小鼠在第7周至第8周的体重显著增加（P＜0.05），见图1。

3.3 LBP对小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清Az-pAb、FSH及E2浓度的影响 实验结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠血清抗透明带抗体浓度有显著性升高（P＜0.01）。与模型组比较，低剂量组小鼠血清抗透明带抗体浓度显著降低（P＜0.05），LBP中、高剂量组及波尼松阳性对照组小鼠血清抗透明带抗体浓度显著降低（P＜0.01），见图2。

图1 对小鼠免疫性卵巢早衰模型的体重改变的影响（¯x，n＝12）

图2 对小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清抗透明带抗体浓度的影响（±s，n＝12）

实验结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠血清FSH浓度有显著性升高（P＜0.01）。与模型组比较，LBP各剂量组及波尼松阳性对照组小鼠血清FSH浓度显著降低（P＜0.01），见图3。

实验结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠血清E2浓度有显著性降低（P＜0.01）。与模型组比较，LBP中剂量组小鼠血清E2浓度显著升高（P＜0.05），LBP高剂量组及波尼松阳性对照组小鼠血清E2浓度显著升高（P＜0.01），见图4。

4 讨论

目前公认为机体发生自身免疫异常，产生抗透明带抗体是导致POF发生的一个重要原因［8］，而抗透明带抗体又可以加速卵母细胞的破坏和耗竭而致POF，因此，本文根据这个机理参考文献［7，9］，以透明带的片段建立了小鼠的自身免疫性POF模型。本实验中POF模型组小鼠外周血中抗透明带抗体浓度明显高于对照，表明该方法能有效诱导抗透明带抗体生产。小鼠的性周期相当于人类的月经周期，可以反映卵巢的功能［10］。本实验中POF模型组小鼠有75%发生性周期紊乱，且有25%性周期延长，表明小鼠的卵泡可能难以发育成熟或不能排卵，不能生成黄体，因而不出现动情后期的表现，与POF患者的卵巢有卵泡丢失、闭锁和无排卵相符合。以上结果说明该模型能够很好的模拟POF的卵巢功能变化。

图3 对小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清FSH浓度的影响（±s，n＝12）

图4 对小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清E2浓度的影响（±s，n＝12）

我国传统医学认为肾气的盛衰直接关系到肾－天癸－冲任－胞宫生殖轴的功能状态，对月经的产生起着主导和决定作用。因肾藏精，主骨生髓，为免疫之本，只有在肾的涵养下，免疫系统才不至于成为无源之水，才能发挥正常的免疫作用。因此，肾主生殖及免疫。自身免疫性POF的病因病机特点是以肾阴虚为主，兼肾阳气不足之肾虚为主导，血虚为基础的肾虚血亏血瘀，Azpab的产生当以肾虚为本。由于肾气不足、肾精亏耗是自身免疫性POF的主要病机，因此补肾、养血活血成为治疗该病的关键。枸杞在我国已有几千年的药用历史，具有“滋阴补血，益精明目”之功效。近年来，大量研究表明，LBP为其主要的生物活性成分，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用［11］。本研究显示，与模型组小鼠比较，LBP治疗组能改善了小鼠的性周期紊乱，降低血清抗透明带抗体、FSH的浓度，提高血清E2的浓度，并在第7周至第8周时体重显著增加，结果表明LBP具有调节内分泌功能，减缓抗透明带抗体所致的小鼠卵巢损伤，对卵巢功能有一定的保护作用。LBP的保护作用可能与其免疫调节功能有关，其机制可能为：一方面，直接作用于T细胞、B细胞等主要免疫活性细胞，调节机体的细胞免疫和体液免疫功能；另一方面，可能作用于下丘脑，通过神经通路作用于免疫系统，从而发挥对整体免疫功能的调节作用［12］。

［1］ 乐杰，谢幸.妇产科学教师用书（本科临床）［M］.北京：人民卫生出版社，2008.

［2］Orshan SA，Furniss KK，Forst C，et al.The lived experience of premature ovarian failure［J］.J Obstet Gynecol Neonatal Nurs，2001，30（2）：202－208.

［3］Pasquali EA.The impact of premature menopause on women′s experience of self［J］.JHolist Nurs，1999，17（4）：346－364.

［4］ 朱玲，罗颂平，许丽绵，等.左归丸对卵巢早衰小鼠免疫功能的影响［J］.中华中医药学刊，2008，26（6）：1157－1160.

［5］ 朱玲，罗颂平.卵巢早衰的病因病机及其证治［J］.中医药学刊，2003，21（1）：143－144.

［6］ 陈秀芳.辨证治疗卵巢早衰22例［J］.四川中医，2000，18（1）：35－36.

［7］ 李娜.丙酸睾酮治疗小鼠自身免疫性卵巢早衰及其机制的研究［D］.中南大学，2011.

［8］Kimura S，Matsumoto T，Matsuyama R，etal.Androgen receptor function in folliculogenesis and its clinical implication in premature ovarian failure［J］.Trends Endocrinol Metab，2007，18（5）：183－189.

［9］ 付莉.卵巢早衰动物模型的建立及口服耐受治疗自身免疫性卵巢早衰的相关研究［D］.长春：吉林大学，2005.

［10］金岩.小鼠发育生物学与胚胎实验方法［M］.北京：人民卫生出版社，2005.

［11］齐春会，张永祥，赵修南，等.枸杞粗多糖的免疫活性［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，15（3）：180－184.

［12］李英杰，齐春会，张永祥.枸杞多糖免疫调节作用机制研究进展［J］.中国新药杂志，2004，13（10）：882－886.

The protective effect of lycium barbarum polysaccharide on model of autoimmune premature ovarian failure in m ice

HUANG Tian，ZHENG Xiao-xia，QIU Xiao-hua，WANG Yan
（The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou 515041，China）

ObjectiveTo evaluate the protective effectof lycium barbarum polysaccharide（LBP）onmodel of autoimmune premature ovarian failure in mice.MethodsThe model of autoimmune premature ovarian failure was induced by Pzp3 to simulate the premature ovarian failure（POF）changes.The protective effects of LBPwere investigated in thismodel.ResultsLBP treatment significantly improved the estrous cycle disorder，reduced the levels of the serum AzpAb，follicle－stimulating hormone（FSH），enhanced the level of the serum estradiol（E2）and gained weight between the 7 weeks to 8 weeks as compared with themodel group.ConclusionLBP offerred therapeutic effect against Pzp3－induced autoimmune premature ovarian failure inmice.

Lycium barbarum polysaccharide；Premature ovarian failure；Mice

R285

A

2095－5375（2014）08－0437－004

广东省中医药局科研基金（No.20111236）

黄恬，女，副主任医师，研究方向：妇科内分泌，E－mail：tian_stb＠163.com