抗鸡传染性法氏囊病病毒单链抗体库的构建及其中和抗体的筛选

周 兵，李天鹤，李 宁，徐黎明，郭 茉，马 蕾，张瑛杰，叶贤龙，赵景壮，衣春霖，韩晓辉，丁良君，李德山*

(1.东北农业大学 生命科学学院/生物制药教研室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国科学院大学 生命科学学院，北京 100049；3.国家知识产权局专利局 专利审查协作北京中心，北京 100083；4.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性高度接触性传染病。该病主要侵害3 周龄～6 周龄鸡，以损害法氏囊中的淋巴细胞为特征[1]。除直接引起鸡死亡与生产性能下降外，还可以增加感染鸡对其他病原体的易感性以及引起鸡对疫苗免疫应答能力的下降[2]。VP2 既是IBDV 的主要结构蛋白，又是病毒的主要宿主保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异、细胞凋亡等有关[3]。疫苗接种是预防IBD 的主要方法，近年来由于超强毒株(vvIBDV)的出现，使得IBD 的防制面临新的困难。高免血清和卵黄抗体对IBD 具有良好的预防和治疗效果，但由于成本和安全性等原因其应用受到限制。而基因工程重组抗体作为高亲和性、以蛋白为基础的靶向诊断和治疗用生物制品，在病毒性疾病防制方面越来越受到重视。

本实验通过构建抗IBDV 细菌展示单链抗体(scFv)库并表达了抗IBDV 的scFv，采用ELISA 和体外中和试验对纯化后的抗体进行活性鉴定，获得了具有中和活性的抗IBDV 的scFv，为今后开发出疗效更好的治疗药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 DF1 细胞、pET-27b(+)载体、E.coli DH5α 及Rosetta 株由本实验室保存；含有(Gly4Ser)3linker 的克隆载体pTlinker 及含有NlpA 的细菌表面展示载体pBSD 由本实验室构建；VP2、FITC 标记的VP2 及IBDV B87 疫苗免疫鸡阳性血清由本实验室制备；免疫鸡法氏囊由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；不同IBDV 株购自不同的生物公司；pMD18-T 载体及DNA Marker 购自TaKaRa 公司；HRP 标记的兔抗鸡IgG(IgG-HRP)购自eBioscience 公司；蛋白分子量标准购自Fermentas公司；TRIzol 购自Invitrogen 公司；M-MuLV 逆转录酶购自Promega 公司；AKTA Purifier 100 蛋白层析系统和HiLoad 16/60 Superdex75 pg 柱子购自GE 公司。引物由Invitrogen 公司合成(表1)。

1.2 鸡法氏囊RNA的提取和cDNA的合成 取抗体效价为1∶32 000 的鸡法氏囊组织约100 mg，采用TRIzol 试剂方法提取其总RNA。通过M-MuLV 逆转录酶合成cDNA。

表1 目的片段扩增引物Table 1 Primers used in the amplification of the target gene

1.3 细菌展示sc Fv库的构建 以合成的cDNA 为模板，以P1/P2 和P3/P4 引物，分别扩增VH 和VL基因。通过Hin dⅢ/NheⅠ和Bam HⅠ/XhoⅠ酶切位点，分别插入到含有(Gly4Ser)3linker 的克隆载体pTlinker 中。利用SfiⅠ酶切割分离VH-linker-VL 片段与SfiⅠ酶切的细菌展示载体pBSD 相连，电转化于DH5α 菌株中构建成细菌展示scFv 库。

1.4 细菌展示sc Fv库的流式细胞仪筛选 将scFv库的所有单菌落以培养基稀释，37 ℃培养至OD600nm值约为0.4，经0.25 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h。收集2 mL 培养物，12 000 r/min 1 min。菌体沉淀用1 mL PBS 溶液重悬洗涤3 次，以350 μL 蔗糖(0.75 mmol/L)/Tris(0.1 mol/L)缓冲液重悬，加入35 μL 溶菌酶(10 mg/mL)，逐滴加入700 μL EDTA(1 mmol/L)，振荡混匀，冰上孵育15 min 后加入50 μL MgCl2(0.5 mol/L)溶液，冰上孵育10 min，4 ℃12 000 r/min 离心1 min。原生质球沉淀用PBS洗涤，重悬。同时依次加入10 μL 1 % BSA 和2 μL FITC 标记的 VP2(2 mg/mL)，冰上孵育1 h，12 000 r/min 离心1 min。沉淀用PBS 洗涤，PBS 重悬，采用流式细胞术(FCM)于488 nm 波长激光下检测其荧光强度并分选。同时设置阴性对照(未与FITC 标记的VP2 孵育的原生质球)。将分选出来的细菌进行重组质粒的提取，并电转化至DH5α 中，按上述方法进行第2 轮、第3 轮筛选，将筛选后提取的重组质粒电转化至DH5α 中，挑取单菌落，扩培后按上述方法处理，逐个采用FCM 进行检测，选出亲和力比阴性对照强的克隆，进行测序并分析。

1.5 抗IBDV sc Fv基因的克隆及重组表达 采用引物P5/P6，以阳性重组质粒pBSD-IBDV-scFv 为模板PCR 扩增scFv 基因，胶回收后用NcoⅠ和Hin dⅢ进行双酶切，连接pET-27b(+)载体构建重组质粒pET-IBDV-scFv，经测序正确后转化Rosetta。重组菌经终浓度为0.25 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导培养4 h。收集菌体经超声破碎后离心，分别取上清液和沉淀，进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.6 包涵体的纯化 诱导后菌体离心弃上清液，超声破碎，离心，收集包涵体，洗涤后用溶解缓冲液(8 mol/L 尿素，pH8.0)充分溶解。使用AKTA Purifier 100 蛋白层析系统，进行包涵体蛋白纯化复性，将蛋白于PBS 中过夜透析。进行SDS-PAGE 电泳分析，对其纯度进行分析。并利用紫外分光光度计(ND-1000 型)检测其浓度。

1.7 ELISA检测重组sc Fv的亲和力和特异性 将抗IBDV 的scFv 以浓度梯度400 μg/mL、80 μg/mL、16 μg/mL 和3.2 μg/mL 各100 μL 包被96 孔板检测scFvs 对VP2 的结合能力；将浓度为400 μg/mL 的scFv 包被96 孔板检测scFv 对不同IBDV 株(1-65株、MB 株、BJ836 株、NF8 株、Gt 株和B87 株)的结合能力。设置了只加底物的PBS 组作为背景对照，同时设置了未加VP2 蛋白或IBDV 的阴性对照1，未加高免血清的阴性对照2，未加VP2 蛋白或IBDV 和高免血清的阴性对照3，以及用BSA 或NDV 代替VP2 蛋白或IBDV 的阴性对照4。样品及对照均设置了3 个平行孔。4 ℃包被过夜。采用5 %脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入VP2 蛋白(40 μg/mL)或不同IBDV 株(100 μL)，37 ℃1 h，以IBDV 高免血清为一抗(1∶200)，兔抗鸡IgG-HRP 为二抗(1∶7 500)，以TMB 底物液避光显色5 min，终止显色反应后，酶标仪测定OD450nm值。

1.8 IBDV滴度的测定 将鸡IBDV 疫苗(B87 株，200 μL)接种9 日龄鸡胚，2 d～3 d 后收获尿囊液。重复上述操作两次，获得活力较高的IBDV。待DF1 细胞培养至单层时将IBDV 10 倍倍比稀释(10-1～10-11)，加于96 孔板中，对照组加DMEM，实验组和对照组各8 个复孔，于37 ℃5%CO2培养。逐日观察细胞病变(CPE)并记录结果，观察5 d～7 d。根据Reed-Muench 方法计算TCID50。

1.9 重组sc Fv中和活性的测定 将scFv 按2 倍倍比稀释(400 μg/mL～0.781 μg/mL)，分别与100 TCID50的IBDV 混合，37 ℃孵育1 h。混合液分别加到铺有单层DF1 细胞的96 孔板中，对照组1 加DMEM，对照组2 加100 TCID50的IBDV，实验组和对照组各8个复孔，于37 ℃5 % CO2培养。逐日观察CPE 并记录结果，观察5 d～7 d。

2 结果

2.1 细菌展示sc Fv库的构建 以合成cDNA 第一条链为模板，以P1/P2 和P3/P4 为引物分别扩增VH和VL，胶回收产物分别插入到含有(Gly4Ser)3linker的克隆载体pTlinker 中。利用SfiⅠ对scFv 片段和pBSD 载体酶切，分别胶回收后连接并电转化至DH5α 中，构建细菌展示scFv 库(图1)。测定自制感受态细胞转化效率为2.4×109。

图1 细菌展示scFv 库的构建Fig.1 Construction of pBSD-scFv library

2.2 细菌展示sc Fv库的筛选 将含有pBSD-scFv的阳性菌诱导表达后制备原生质球，应用FCM 进行分析和分选，第一轮筛选P2 门内5 %的细菌，共经3 轮筛选，挑取单菌落进行FCM 检测，挑选荧光信号比阴性高的克隆，筛选出5 株亲和力较高的克隆，分别命名为S1，S2，S3，S4 和S5(图2、图3)。测序结果进行比对分析，结果表明均为鸡源抗体，并且5 株克隆氨基酸同源性为82.16%～87.27%。

2.3 抗IBDV scFv表达及纯化 对重组质粒pETIBDV-scFv 进行PCR 以及Nco Ⅰ/Hin d Ⅲ双酶切鉴定，结果与预期相符(745 bp)。重组质粒测序结果表明抗IBDV scFv 基因正确，并正确构建了原核表达载体。

重组菌经IPTG 诱导表达后将破碎后的菌体上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE 分析，结果表明目的蛋白主要以包涵体形式表达。SDS-PAGE 分析表明，抗IBDV scFv 蛋白的分子量均约为28 ku，与预期结果相符(图4)。

对包涵体进行变性和复性。将复性后蛋白透析后进行SDS-PAGE 分析，出现一条约28 ku 的目的蛋白条带(图4)。高效液相色谱分析结果表明5 个scFv 纯度为85 %～90 %。

图2 scFv 库的流式细胞仪筛选Fig.2 Screening of scFv library by FCM

图3 挑取的5 株克隆经流式细胞仪进行亲和能力检测Fig.3 Affinity detection of scFvs by FCM

图4 scFv 蛋白纯化后的SDS-PAGE 电泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified scFv protein

2.4 ELISA检测重组sc Fv与VP2蛋白和不同IBDV株的特异性结合能力 使用本实验室表达纯化的VP2 蛋白和不同IBDV 株对抗IBDV scFv 进行ELISA 检测。ELISA 结果表明，反应数值随scFv 浓度梯度的增加呈现上升趋势，并且平行性好，数据经T-Text 统计得出样品的p 值与PBS 组以及相应的阴性对照1、2、3、4 组差异极显著(p<0.01)。结果表明scFv 对VP2 蛋白和不同IBDV 株均具有特异性结合能力，并且不同scFv 对不同IBDV 株特异性结合能力不同(图5、图6)。

2.5 重组scFv中和活性的测定 将连续2 倍倍比稀释的5 株scFv 与100 TCID50(TCID50=10-8.2/0.1 mL)的IBDV(B87 株)混合孵育，进行中和活性测定，结果显示，S1 对100 TCID50的IBDV(B87 株)具有较高的中和活性，其100%的中和效价为1∶256(表2)。

图5 ELISA 检测scFv 和VP2 蛋白的特异性和亲和力Fig.5 Specificity and affinity of scFv to VP2 detected by ELISA

图6 ELISA 检测scFv 和不同IBDV 株的特异性和亲和力Fig.6 Specificity and affinity of scFv to different virus strains detected by ELISA

表2 scFv 抗IBDV(B87 株)中和活性的检测Table 2 Neutralization tests of the scFv antibodies against IBDV(B87 strain)

3 讨论

IBD 是对养禽业影响最大、造成经济损失最严重的传染病之一，对IBD 疫苗的研制、开发和应用均值得探讨的。基因工程抗体由于其高专一性、高亲和力、高效性和高可塑性被广泛应用于疾病的临床诊断、预防、治疗及基础理论研究等领域[4]。目前筛选抗体库的方法主要有噬菌体展示技术、酵母展示技术、核糖体展示技术、细菌展示技术等。酵母展示技术库容量偏低[5]，核糖体展示方法技术要求高，条件相对苛刻。细菌内膜展示技术通过NlpA信号肽将抗体片段锚定在细菌内膜的外侧，周质空间的氧化型环境和伴侣因子有利于抗体分子二硫键的正确形成，为抗体的表达提供了一个良好的微环境[6]，而且细菌颗粒较大，抗原和抗体结合后可以应用FCM 观察和分选[7]，通过抗原和抗体的结合，能够直观的反应抗原和抗体的亲和力，根据需要筛选不同亲和力的抗体表达菌株，提高了筛选效率。此外，该技术相对简便易行，只要经过相应的酶切位点就可以直接将抗体的相应片段插入到展示载体中，利用细菌电转化技术便可以获得相对较高库容(109～1010)的抗体库。

单链抗体作为一种新型的基因工程抗体，具有很多的优点：分子量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低，容易穿透组织，不易对身体产生不利影响；无Fc 段，不与具有Fc 受体的非靶细胞结合，其用于免疫诊断时成像清楚，本底低；易于大量生产。此外，scFv 为单个单顺反子，对表达载体的要求相对较低，因此表达载体的构建相对简单易行。使其今后可能发展为治疗疾病的有效药物。

本研究首次获得了抗IBDV 的本动物源抗体，经ELISA 方法检测，证明其对IBDV 具有特异性结合能力，经体外细胞活性检测，证明该scFv 可以有效阻断IBDV 对DF1 细胞的侵染作用，从而进一步证明所获得的scFv 具有中和活性，为研制治疗IBD的抗体药物奠定基础。

[1]Kibenge F S B,Dhillon A S,Russell R G.Biochemistry and immunology of infectious bursal disease virus[J].J Gen Virol,1988,69(8):1757-1775.

[2]Calnek B W.禽病学(10 版)[M].高福，苏敬良.北京：中国农业出版社，1999：914-937.

[3]曾祥伟，王笑梅，高宏雷，等.传染性法氏囊病超强Gx 株的致弱研究[J].中国预防兽医学报，2003，25(2)：140-144.

[4]田辉，白福良，徐黎明，等.错配PCR 技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28(7)：722-725.

[5]李月红，张国力，岳玉环，等.细胞黏附分子1(ICAM-1)ScFv 基因原核载体的构建及表达[J].中国兽医学报，2012，32(5)：725-727.

[6]尹惠琼.单链抗体的研究进展[J].动物医学进展，2003，24(2)：4-26.

[7]Wright A,Shin S U,Morrison S L.Genetically engineered antibodies:progress and prospects[J].Crit Rev Immunol,1992,12(3-4):125-168.