重组乳酸乳球菌表达外源蛋白的研究进展

刘淑杰，李永明，徐子伟

(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类能够发酵碳水化合物产生主要终产物为乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌，该菌被广泛地应用于食品生产工业和发酵领域，是公认的安全级(GRAS)微生物。乳酸菌在自然界分布广泛，是人和大多数动物肠道内常见菌群，具有调节肠道微生态平衡、促进营养物质吸收及增强免疫力等功能，对维持机体健康具有重要作用。近年来乳酸菌基因工程取得重大进展，乳酸菌作为一种新型宿主菌用来表达外源蛋白已在生物医药、食品工业和畜牧兽医等领域备受关注。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳酸菌的模式菌株，具有生长迅速、免疫原性弱、自身分泌蛋白数量少等特点，成为表达外源蛋白的理想候选者。目前，建立和发展了一系列克隆和表达系统，利用L.lactis 已表达多种类型外源蛋白(消化酶、外源抗原、细胞因子和促生长激素等)[1-2]。在畜牧兽医领域，采用L.lactis 已开展广泛的研究，特别是表达疾病相关抗原作为活载体口服疫苗用于畜禽疾病防治，表达消化酶、活性肽等作为新型饲料添加剂用于改善动物生理机能、生产性能等。具有重要功能的活性蛋白在L.lactis 中成功的表达，将为畜禽健康养殖提供一条重要的途径。

1 L.lactis表达系统

1.1 L.lactis组成型表达系统 组成型表达载体一般由启动子、复制子、多克隆位点和筛选标记等部分组成，其中启动子是调控基因表达水平关键元件之一。组成型启动子是指在该启动子控制下，结构基因的表达水平通常恒定在一定水平上，在不同组织和部位表达水平没有明显差异。L.lactis 大部分启动子是随机从基因组文库中分离出来，并带有氯霉素抗性的报告基因cat-86。目前己分离P21、P23、P32、P44 和P59 等组成型启动子，根据氯霉素乙酰基转移酶活性区分出强启动子(P21，P23 和P59)和弱启动子(P32 和P44)。以L.lactis subsp.cremoris 蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建了L.lactis 第一个组成型表达载体，Guchte 等构建了第二个组成型表达载体pMG36e，该载体是目前应用较多的一个典型组成型表达载体。pMG36e 载体包括P32 强启动子、红霉素和氯霉素抗性基因、prtp 转录终止子以及pWV01 复制子[3]。pMG36e 载体也能在大肠杆菌、枯草杆菌和乳酸杆菌中复制，将大肠杆菌、枯草杆菌作为构建重组载体的中间宿主，可以提高载体表达效果，扩大其宿主范围。目前，采用pMG36e 载体已经成功的表达多种外源蛋白，如β-半乳糖苷酶(lacZ)、幽门螺杆菌Cag7-ct383 蛋白，磷酸山梨醇脱氢酶等。

1.2 L.lactis诱导型表达系统 组成型表达系统的建立使多种外源蛋白在L.lactis 中成功表达，但持续高水平表达会导致外源蛋白在细胞内堆积、降解，并且对宿主菌的生长和代谢造成毒害作用。为了防止负面效果产生，可以在表达系统中引入诱导信号，调控外源蛋白的时相表达，使细菌生长与外源基因高效表达分开。针对此问题发展起一系列适合L.lactis 的诱导表达系统，通过对诱导物或诱导条件(糖、PH、温度、乳酸菌肽等)调节使目的蛋白得到持续、高效表达。

最初用于调控基因表达是含有lacA 启动子的L.lactis乳糖操纵子系统，该系统通过自我调节的LacR 阻遏物调控基因表达，不受乳糖分解代谢产物的阻遏，而是通过中间产物6-磷酸塔格糖抑制乳糖的产生[4]。该系统受中间产物调节，其浓度不易控制，诱导表达蛋白水平相对较低。Wells 等将大肠杆菌噬菌体T7 聚合酶基因克隆到lacA 启动子下游，使基因表达受乳糖的调节，当细胞产生乳糖时诱导发生，并可显著增加T7 启动子下游目的基因的表达水平[5]。采用该系统表达破伤风毒素片段C，目的蛋白产量占细胞总蛋白的22 %[5]。

一些表达调控系统可通过改变环境条件来调节基因的表达水平。将转座子插入lacZ 基因上，使L.lactis 不同染色体基因座发生融合而产生数百个表达lacZ 的重组子。带有PA170 启动子的重组子表达lacZ 的量最高，细胞在pH5.2 条件下产生的酶活性高于pH7.0 时的酶活性，在低温条件产生的酶活性高于高温下的酶活性[6-7]。将来自PA170 的DNA 克隆到多拷贝载体上，转化L.lactis 后，则表现出相似的调节模式，在不同的条件下，蛋白诱导表达水平在8～50 倍左右[6]。该系统可用来表达毒素蛋白或者在低温条件下表达易降解的蛋白，也可用于发酵工程，通过培养物中酸的积累进行自我调节蛋白表达。

利用裂解噬菌体的复制子和表达信号建立了L.lactis噬菌体Φ31 爆发式诱导表达系统。该系统以噬菌体Φ31为启动子，将lacZ 作为报告基因克隆至Φ31 启动子下游，当Φ31 感染L.lactis 后可使其产生大量的lacZ。在低拷贝数的表达质粒中引入噬菌体复制子，表达载体处于低拷贝状态时，L.lactis 仍然能正常生长[8]。当宿主菌被噬菌体Φ31 感染后，表达质粒大量复制，在1 h～2 h 内目的基因的表达量可以迅速增加到1 000 倍以上[8]。该系统在短时间内合成大量的外源蛋白，最后细胞破裂，表达的蛋白被释放，由此称为爆发式表达。令人遗憾地是该系统存在特定的寄主噬菌体交互作用，不能在生产上大规模使用。

乳链菌肽(Nisin)诱导表达系统(Nisin controlled expression system，NICE)是目前最为有效、应用最为广泛的L.lactis 食品级诱导表达系统。Nisin 是一个含有34 个氨基酸的多肽，安全无毒性，常被用做食品防腐剂。Nisin 的生物合成涉及从A 到G 的11 个基因，该基因簇位于L.lactis 染色体的一个接合型转座子上，其中nis R 和nis K 是重要的反应调节基因[9]。当诱导剂nisin 与nis K 结合后，nis K 磷酸化并把磷酸基团转移给nis R，激活nis R 从而转录基因簇中的两个启动子，诱导下游基因的转录表达。将nis K 和nis R 整合到L.lactis 的pepN 基因中，目的基因插入含有PnisA 启动子的质粒上，则可以实现nisin 自主调节基因表达[10]。NICE 系统易于操作，诱导物nisin 的浓度和外源蛋白表达量之间呈线性关系，诱导效率可达1 000倍以上。NICE 系统已经被用来表达致病抗原、代谢酶、细胞因子及一些毒素蛋白等，用于致病菌的遗传学、生物学功能、代谢工程和黏膜免疫等方面研究。

2 L.lactis表达外源蛋白的策略

根据研究目的不同，确定外源蛋白在L.lactis 中的定位表达非常重要，L.lactis 表达外源蛋白主要有细胞内表达、细胞外分泌及表面展示3 种方式，重组蛋白表达定位不同，其产量、活性和在机体内作用效果往往不同(表1)。当L.lactis 被作为“细胞工厂”来生产外源蛋白时，采用分泌表达更为可取。分泌表达可以连续培养宿主菌，避免外源蛋白被胞内蛋白酶降解，提高蛋白产量，简化纯化步骤。另外，分泌表达的外源蛋白(酶或抗原等)在人或动物消化道内可直接与受体(底物或免疫系统)充分接触和作用，发挥重组蛋白的最大生物活性。当L.lactis 作为活菌载体表达抗原蛋白或活性肽类时，也可以采用在细胞表面展示外源蛋白的策略。细胞表面展示可以保持外源蛋白相对独立的空间结构和生物活性，使相关反应直接在细胞表面发生，提高反应效率。细胞表面展示技术将L.lactis 的基因工程提升到一个新的领域，在活菌疫苗、生物酶制剂、生物吸附剂和构建多肽文库等研究方面展现出良好的发展前景[11-12]。

表1 L.lactis 表达外源蛋白的策略

2.1 L.lactis分泌表达外源蛋白 分泌表达的外源蛋白首先被宿主菌合成由成熟蛋白和N 端信号肽组成的前体蛋白，在信号肽(SP)引导下目的蛋白跨膜转运，最后信号肽被切除，成熟蛋白被释放到胞外。信号肽是影响外源蛋白分泌的首要因素，Usp45 是L.lactis 主要分泌蛋白，SPUsp45被认为是目前分泌效率最好的信号肽。以葡萄球菌核酸酶(Nuc)作为报告蛋白，采用SPUsp45构建分泌表达载体pSEC∶Nuc，使得重组L.lactis 分泌表达Nuc 量是细胞内表达量的6 倍多，分泌效率约为70 %[13]。研究比较SPUsp45和Nuc自身信号肽SPNuc的分泌效率，结果显示采用SPUsp45的Nuc分泌效率约为95%，采用SPNuc 的Nuc 分泌效率为60%，表明利用宿主菌同源信号肽可增加L.lactis 分泌效率。进一步分析L.lactis 同源信号肽的分泌效率，SP310(L.lactis未知蛋白信号肽)显示较高的Nuc 分泌量，但分泌效率仍明显低于SPUsp45。对SP310进一步优化，优化的SP310mut2可将Nuc 分泌表达量提高45 %，但采用SP310mut2表达蔗糖异构酶(SIase)，却有60 %的重组酶滞留在细胞内，表明外源蛋白也会影响信号肽的分泌效率[14-15]。另外，研究显示，以乳酸杆菌的S-层蛋白定位排列为基础设计的SPSLPmod，使重组L.lactis 分泌表达mIL-12 产量是SPusp45的4 倍[16]。

L.lactis 分泌效率还依赖成熟蛋白N 端所带的净电量即负电荷。N 端带有碱性氨基酸或带正电荷的肽会显著降低分泌效率，而出现中性、酸性氨基酸或带负电荷的肽则可改善分泌效率。研究发现，在信号肽与成熟蛋白N 末端之间插入9 个氨基酸合成肽LEISSTCDA(带有2 个负电荷)，能够提高NucB、NucT、huIFN-a2b 等外源蛋白的分泌效率，LQVDDIPSA(带有2 个负电荷)和LGISSTCNA(不带电荷)合成肽同样能够改善L.lactis 分泌效率，这些肽在组成上都避免采用碱性氨基酸。另外，对于易降解的蛋白来说，可通过融合一个稳定的蛋白来增加其分泌表达量。将布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12 与稳定的Nuc 融合，构建pSEC∶Nuc∶L7/L12 分泌表达载体，可使L.lactis 分泌L7/L12 量增加2.5 倍[17]。牛β-乳球蛋白(BLG)与Nuc 融合后，增加了BLG 分泌表达量，当LEISS 与Nuc-BLG 进行融合表达时，融合蛋白分泌表达量是Nuc-BLG 的2 倍[18]。

2.2 L.lactis细胞表面展示外源蛋白 细胞表面展示是指将外源蛋白(乘客蛋白)与特定的表面蛋白(运载蛋白)进行融合后转入宿主细胞，通过后者的表面识别和定位功能使外源蛋白在细胞表面表达。细胞表面展示外源蛋白要求运载蛋白除了含有信号肽外，还应具有锚定单元的定位结构，能够将外源蛋白牢固定位在细胞表面(图1)。L.lactis最常用的锚定单元是LPXTG 类型细胞壁锚定域(CWA)，该类型具有较强的锚定性能，CWA 一般包括分捡信号LPXTG、约30 个氨基酸构成的疏水区和C 端较短的带正电荷氨基酸尾部。金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的CWA是研究革兰氏阳性菌表面锚定机制的典型模式，外源蛋白首先在宿主菌内被合成前体肽，信号肽引导前体肽跨膜，在分选酶的作用下，LPXTG 基序中苏氨酸与甘氨酸之间的肽键被蛋白酶水解，C 末端的苏氨酸共价连接到位于肽聚糖层的五肽甘氨酸上，从而使外源蛋白锚定到细胞表面[19]。L.lactis 蛋白水解酶PrtP、保加利亚乳杆菌蛋白水解酶PrtB、酿脓链球菌M6 蛋白等均含有LPXTG 基序。采用该类型锚定序列已成功在L.lactis 表面展示了多种外源蛋白，如幽门螺杆菌尿素酶B 亚基E 片段(ureBE)、恶性疟原虫裂殖子芽孢MSA2 和布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12 等。

图1 乳酸乳球菌表面展示外源蛋白元件示意图

N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(N-acetylglucosaminidase，AcmA)是L.lactis 的一种肽聚糖水解酶，也是一种自溶素，参与细胞分离、分裂及稳定期菌体自溶过程，因具有细胞壁锚定性质已被用来构建L.lactis 表面展示系统，是一个很有研究潜力的运载蛋白。AcmA 主要由N 端活性结构域和C 端肽聚糖锚定结构域(cA 结构域)组成，C 端结构域由3 个高度同源性的重复序列组成，其中每个重复序列由45 个氨基酸组成，也称作LysM 域，可与肽聚糖高度特异性结合。AcmA 锚具有独特的优点：(1)即使保留C 端结构域中的一个重复序列，外源蛋白也能锚定在细胞壁上，可用来展示分子量较大的外源蛋白；(2)外源蛋白能够从细胞外向细胞壁回向锚定，在一个细胞壁上能够展示多个外源蛋白。但有研究显示，带有AcmA 锚的L.lactis 展示的外源蛋白存在于细胞表面和培养介质中，显示LysM 定位于细胞壁的功能要弱于LPXTG 类型锚，这可能由于L.lactis 细胞壁成分阻碍LysM 结合到细胞肽聚糖上[20]。Okano 等将α-淀粉酶(AmyA)与AcmA 的C 端肽聚糖结合域进行基因融合，AmyA 成功展示在L.lactis 细胞表面，但酶活性却被抑制，当增加cA 结构域的数量则融合蛋白产量随之增加，采用3 个重复域作为锚定蛋白时，可以检测到82 %的酶活性[21]。

2.3 L.lactis表达外源蛋白的生物活性 L.lactis 具有安全、益生和免疫佐剂等优点，被认为是一种具有极大潜力的活疫苗载体。Norton 等采用L.lactis 表达模式抗原破伤风毒素片段C，通过灌胃和鼻接种途径免疫小鼠，能够诱导其产生黏膜和系统免疫反应，有效地保护了小鼠抵抗致死剂量毒素片段的攻毒[22]。Marelli 等构建了表达轮状病毒突起蛋白亚基VP8 的重组L.lactis，口服免疫小鼠重组L.lactis，细胞内表达VP8 的重组L.lactis 能够显著增加肠道IgA 抗体水平，预防轮状病毒感染效率达50 %；表面表达VP8 的重组L.lactis 诱导小鼠在肠道和系统水平均产生特异性抗体，完全阻止轮状病毒感染[23]。Hugentobler 等采用L.lactis 分别表达利什曼原虫保护性抗原LACK 和鼠源IL-12，同时皮下免疫小鼠两种重组菌，能诱导小鼠产生抗原特异性多功能TH1 CD4+、CD8+T 细胞和LACK 特异性TH1 免疫反应，可显著延缓利什曼原虫感染引起的小鼠足垫肿胀反应[24]。Liu 等构建表达肠毒性大肠杆菌粘附素FaeG 的重组L.lactis，通过口服途径免疫小鼠，诱导产生特异性黏膜和系统免疫反应，并且脾脏、派伊尔结和肠系膜淋巴结产生特异性抗体分泌细胞[25]。

L.lactis 作为宿主菌的独特魅力使其在表达酶类、抗菌肽和活性蛋白等方面同样具有突出的优势。Li 等构建了表达食品级LacZ 的重组L.lactis MG1363/FGZW，乳糖不耐症小鼠口服重组菌后，能够显著地缓解摄取乳糖后的腹泻症状[11]。尹建洪等构件了食品级L.lactis 表达载体，并成功表达南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，经验证重组酶具有活性[26]。Azevedo 等采用木糖诱导表达系统，构建表达麻风分枝杆菌65 ku 热应激蛋白(Hsp65)的重组L.lactis，重组菌分泌表达Hsp65 量约7 mg/L，对鲎变形细胞溶解物分析显示，在重组Hsp65 样品中LPS 含量比美国食品和药品管理局规定水平还低10～100 倍[27]。白彩明等采用L.lactis 表达小肠三叶因子(ITF)，在诱导成年兔胃溃疡后，采用重组L.lactis 进行灌胃能促进胃溃疡黏膜再生[12]。

3 L.lactis表达载体的选择标记

为了筛选合适的转化子并在基因改造后保持一定的选择压力，表达载体需要带有选择性筛选标记。传统的L.lactis 表达载体通常带有红霉素、氯霉素等抗性基因，但由于抗性因子具有转移性，将载体投放到外界环境会带来生物安全隐患，解决该问题最有效方法是构建食品级选择性标记的表达载体。目前已建立的L.lactis 食品级选择标记主要有3 类：(1)糖利用选择标记。根据L.lactis 具有发酵某种糖类的表型特征建立起来的，主要包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。如蜜二糖是乳酸菌的特殊发酵物，α-半乳糖苷酶(aga)是其代谢降解的关键酶，由于L.lactis通常不能利用蜜二糖，因此可将棉子糖乳球菌aga 基因的Mel+表型特征开发为载体选择标记，Boucher 等利用aga基因作为选择标记成功构建了载体pRAF800[28]。(2)营养缺陷标记。主要包括编码丙氨酸消旋酶(alr)、编码胸苷酸合成酶(thyA)、参与天冬氨酸到苏氨酸的转化过程(thr)、supB 和supD(无义抑制基因)。如孙强正等构建以thy 为选择标记的载体pSH91，thyA 基因缺陷的突变株在基础培养基上不能生长，但将pSH91 转化突变株L.lactis MBP71后，突变株恢复了野生型表型[29]。(3)细菌素抗性或免疫性标记。细菌能分泌多种细菌素，可利用细菌素的免疫基因和抗性基因作为载体选择标记。研究较为深入的细菌素是nisin，采用nisin 抗性基因(nsr)和免疫基因(nisI)作为选择标记已成功构建食品级表达载体。Takala 等利用nisI 作为选择标记构建了表达载体pLEB590，并成功表达脯氨酸亚氨基肽酶PepI[30]。

4 存在问题与展望

虽然基因工程技术发展已相对成熟，但是作为一种新型的宿主菌，L.lactis 还存在不足之处。首先，L.lactis 表达的外源蛋白普遍存在产量低的问题，有些蛋白无法通过SDS-PAGE 电泳进行检测；其次，L.lactis 诸多的表达载体仍以红霉素、氯霉素等抗生素为筛选标记，所以仍存在抗性基因向环境或内源微生物转移的生物安全隐患；第三，重组L.lactis 通过口服途径进入人或动物消化道，重组蛋白要经历胃酸、胆盐和酶的破坏，到达肠道发挥作用的数量、活性和作用机制仍无法确定；第四，L.lactis 表达的一些外源蛋白活性较弱，提高外源蛋白的生物活性是今后研究的重点；第五，L.lactis 宿主菌还仅限于个别菌株，并且多为无质粒营养缺陷型株，在大规模生产条件下难以存活，所以应开发更多、更有效的宿主菌株；第六，目前关于多功能益生菌或重组活菌疫苗的研究还处于体外实验和动物实验阶段，距临床或实际应用还需要一段时间。

尽管存在以上种种问题，但随着基因工程研究的不断深入，以及分子生物学、免疫学、生态学和胃肠病学等不同学科知识的融合，将更好地解决L.lactis 表达外源蛋白普遍存在的问题，进一步促进绿色、食品级的多功能L.lactis 研制和开发，作为安全级宿主菌的L.lactis 将更具魅力和前景，更有力地推动生物医药、食品工业和畜牧兽医业的持续健康发展。

[1]Zhang Qiu-xiang,Zhong Jin.Expression of hepatitis B virus surface antigen determinants in Lactococcus lactis for oral vaccination[J].Microbiol Res,2011,166(2):111-120.

[2]刘淑杰,李永明,徐子伟,等.ETEC 粘附素蛋白亚基Fae G在乳酸乳球菌中的表达及免疫反应性分析[J].中国预防兽医学报，2009，31(9)：688-692.

[3]Guchte M,Vossen J M,Kok J,et al.Construction of a lactococcal expression vector:expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.Lactis[J].Appl Environ Microbiol,1989,55(1):224-228.

[4]de Vos W M,Vaughan E E.Genetics of lactose utilization in lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,1994,15(2-3):217-37.

[5]Wells J M,Wilson P W.Lactococcus lactis:high-level expression of tetanus toxin fragment C and protection against lethal challenge[J].Mol Microbiol,1993,8(6):1155-1162.

[6]Israelsen H,Madsen S M,Vrang A,et al.Cloning and partial characterization of regulated promoters from Lactococcus lactis Tn917-lacZ integrants with the new promoter probe vector,pAK80[J].Appl Environ Microbiol,1995,61(7):2540-2547.

[7]Madsen S M,Arnau J.Molecular characterization of the pHinducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis[J].Mol Microbiol,1999,32(1):75-87.

[8]O'Sullivan D J,Walker S A,West S G.Klaenhammer TR.Development of an expression strategy using a lytic phage to trigger explosive plasmid amplification and gene expression[J].Biotechnology(N Y),1996,14(1):82-87.

[9]Kuipers O P,Beerthuyzen M M,de Ruyter P G,et al.Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction[J].J Biol Chem,1995,270:27299-27304.

[10]Kuipers O P,Ruyter P,Kleerebezem M,et al.Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria[J].J Biotechnol,1998,64:15-21.

[11]Li Jing-jie,Zhang Wen,Wang Chuan,et al.Lactococcus lactis expressing food-grade β-galactosidase alleviates lactose intolerance symptoms in post-weaning Balb/c mice[J].Appl Microbiol Biotechnol,DOI 10.1007/s00253-012-3977-4.

[12]白彩明，毕研伟，杨旭，等.小肠三叶因子在乳酸菌中的表达[J].中国生物工程杂志，2009，29(10)：23-27.

[13]Ravn P,Arnau J,Madsen S M,et al.The development of TnNuc and its use for the isolation of novel secretion signals in Lactococcus lactis[J].Gene,2000,242:347-356.

[14]Ravn P,Arnau J,Madsen S M,et al.Optimization of signal peptide SP310 for heterologous protein production in Lactococcus lactis[J].Microbiology,2003,149(Pt 8):2193-2201.

[15]Park J Y,Jung J H,Seo D H,et al.Microbial production of palatinose through extracellular expression of a sucrose isomerase from Enterobacter sp.FMB-1 in Lactococcus lactis MG1363[J].Bioresour Technol,2010,101(22):8828-8833.

[16]Fernandez A,Horn N,Wegmann U,et al.Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(3):869-871.

[17]Ribeiro L A,Azevedo V,Le Loir Y,et al.Production and Targeting of the Brucella abortus Antigen L7/L12 in Lactococcus lactis:a First Step towards Food-Grade Live Vaccines against Brucellosis[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(2):910-916.

[18]Nouaille S,Bermúdez-Humarán L G,Adel-Patient K,et al.Improvement of bovine beta-lactoglobulin production and secretion by Lactococcus lactis[J].Braz J Med Biol Res,2005,38(3):353-359.

[19]赵朋朋，肖丽英，李继遥.蛋白酶sortase 的研究进展[J].国外医学口腔医学，2006，33(1)：18-25.

[20]Andre G,Leenhouts K,Hols P,et al.Detection and localization of single LysM-peptidoglycan interactions[J].J Bacteriol,2008,190(21):7079-86.

[21]Okano K,Zhang Qiao,Kimura S,et al.System using tandem repeats of the cA peptidoglycan-binding domain from Lactococcus lactis for display of both N-and C-terminal fusions on cell surfaces of lactic acid bacteria[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(4):1117-1123.

[22]Norton P M,Wells J M,Brown H W,et al.Protection against tetanus toxin in mice nasally immunized with recombinant Lactococcus lactis expressing tetanus toxin fragment C[J].Vaccine,1997,15(6-7):616-619.

[23]Marelli B,Perez A R,Banchio C,et al.Oral immunization with live Lactococcus lactis expressing rotavirus VP8 subunit induces specific immune response in mice[J].J Virol Methods,2011,175(1):28-37.

[24]Hugentobler F,Yam K K,Gillard J,et al.Immunization against Leishmania major infection using LACK-and IL-12-expressing Lactococcus lactis induces delay in footpad swelling[J].PLoS One,2012,7(2):e30945.

[25]Liu Shu-jie,Li Yong-ming,Xu Zi-wei,et al.Immune responses elicited in mice with recombinant Lactococcus lactis expressing F4 fimbrial adhesin FaeG by oral immunization[J].Vet Res Commun,2010,34:491-502.

[26]尹建洪，罗立新，王成.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因在乳酸乳球菌MG1363 中的整合及表达[J].生物技术通报，2012，5：105-109.

[27]de Azevedo M S,Rocha C S,Electo N,et al.Cytoplasmic and extracellular expression of pharmaceutical-grade mycobacterial 65-kDa heat shock protein in Lactococcus lactis[J].Genet Mol Res,2012,11(2):1146-1157.

[28]Boucher I,Parrot M.Novel food-grade plasmid vector based on melibiose fermentation for the genetic engineering of Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,2002,68:6152-6161.

[29]孙强正，熊衍文，李振军，等.乳酸乳球菌食品级载体的构建及Mn-SOD 基因的克隆和表达[J].中国人兽共患病学报，2006，22(6)：498-501.

[30]Takala T M,Saris P E.A food-grade cloning vector for lactic acid bacteria based on the nisin immunity gene nisI[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(4-5):467-471.