甲流病毒NS基因降低H5N1禽流感病毒对小鼠的致病力的研究

孔晖晖，张乾义,2，张 莹，谷春阳,2，姜永萍，关云涛，陈化兰,2*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070)

H5N1 禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)具有高的致病性[1]，而2009 年爆发的墨西哥甲型H1NI 流感，虽然传播效率很高，但其致病性却只略高于一般的季节性流感[2]。研究表明，流感病毒的致病性是由多个基因决定的。其中HA 和PB2 基因对流感病毒的致病性具有重要影响[3-4]。同时，NS基因同样也影响流感病毒的致病性，如H5N1 AIV的NS1 蛋白中S42P 突变可以导致其对小鼠的致病力减弱或对猪(D92E)和鸡(V149A)的致病力增强[5-7]。此外，2001 年和2003 年我们从福建省猪体内分离到两株H5N1 AIV，由于其中一株在NS 基因发生了15 个氨基酸的连续缺失导致其对鸡的致死性与未发生缺失的另一株相比显著降低[8]。

本研究利用反向遗传技术，将一株H5N1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)的NS 基因替换为我国首例甲型H1N1 流感病毒分离株A/Sichuan/01/2009(SC/01)的NS 基因，拯救出一株H5N1 重组病毒(DK/35-SC/01-NS)，并初步评估了DK/35-SC/01-NS对小鼠的致病性。为进一步研究NS 基因对流感病毒致病性的影响机制奠定了基础，也为研制弱毒活疫苗提供了一种新的策略。

1 材料和方法

1.1 重组质粒、鸡胚及实验动物 本研究所用重组质粒由本实验室构建和保存；所用的9～11 日龄鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄SPF 雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂及引物 TRlzol LS RNA 提取试剂盒与反转录酶均购自Invitrogen 公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；DNA 测序试剂盒购自Applied Biosystems 公司；扩增及测序引物(如读者需要引物序列信息作者可以提供)。

1.3 病毒拯救及病毒滴定 参照文献[9]的方法进行病毒拯救。病毒尿囊液用PBS 10 倍倍比稀释为10-5～10-10梯度，每个滴度接种5 枚9～11 日龄鸡胚，0.1 mL/胚，37 ℃孵育48 h，后收集尿囊液进行血凝实验，用Reed-Muench 算法计算EID50。

1.4 MLD50测定试验 测定病毒的EID50后，用PBS 将病毒尿囊液10 倍倍比稀释(107EID50/50 μL～101EID50/50 μL)。经鼻腔接种5 只小鼠，每天称重，记录小鼠的存活情况。

2 结果与讨论

2.1 病毒拯救及EID50测定 按反向遗传操作方法分别拯救DK/35 和DK/35-SC/01-NS 病毒，收集病毒尿囊液，对其各基因节段进行RT-PCR 扩增及测序。测序结果表明，所拯救病毒的序列与预期相符。测定所拯救病毒的EID50，结果表明DK/35-SC/01-NS在鸡胚上的复制滴度高达9.3 logEID50，DK/35 为7.7 logEID50，表明SC/01 的NS 基因能够与DK/35很好的兼容。

2.2 MLD50测定试验 将DK/35 和DK/35-SC/01-NS的病毒尿囊液10 倍梯度稀释(107EID50/50 μL～101EID50/50 μL)，经鼻腔感染5 只6 周龄左右的BALB/c小鼠，连续观察14 d，记录体重变化及死亡情况。DK/35(图1)和DK/35-SC/01-NS(图2)的MLD50分别为2.6 log 10 EID50和5.9 log 10 EID50。两者间的致死剂量相差高达2 000 倍。研究表明NS 具有拮抗干扰素的作用[5-8]，我们推测SC/01 的NS 基因主要是通过调节宿主干扰素的产生致弱了DK/35 的毒力。而NS 与宿主相互作用改变致病力的具体机制仍需要进一步研究。

图1 DK/35 鼻腔感染后的致死情况Fig.1 The virus pathogenicity to mice inoculated intranasally with different dose of DK/35

图2 DK/35-SC/01-NS 鼻腔感染后的致死情况Fig.2 The virus pathogenicity to mice inoculated intranasally with different dose of DK/35-SC/01-NS

流感病毒的致病力与病毒本身的特性以及宿主密切相关，NS 基因是A 型流感病毒的主要致病因子之一。Zhou 等通过改变NS1 蛋白的氨基酸，制备了应对2009 H1N1 流感病毒的弱毒活疫苗[10]，表明通过改变流感病毒的NS 基因制备弱毒活疫苗有很好的应用前景。本研究用SC/01 的NS 基因替换DK/35 的NS 基因，成功的致弱了H5N1 亚型流感病毒，为进一步对致弱机制进行系统的研究提供了材料，也为生产弱毒活疫苗提供了一种新策略和理论支持。

[1]http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/index.html.

[2]Yasushi I,Kyoko S,Maki K,et al.In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses[J].Nature,2009,460:1021-1025.

[3]Hatta M,Gao Peng,Halfmann P,et al.Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1influenza A viruses[J].Science 2001,293(5536):1840-1842.

[4]Li Ze-jun,Chen Hua-lan,Jiao Pei-rong,et al.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalianmouse model[J].J Virol,2005,79(18):12058-12064.

[5]Jiao Pei-rong,Tian Guo-bin,Deng Guo-hua,et al.A singleamino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice[J].J Virol,2008,82(3):1145-1154.

[6]Seo S H,Hoffmann E,Webster R G,et al.Lethal H5N1 influenza viruses escape host antiviral cytokine responses[J].Nat Med,2002,8(9):950-954.

[7]Li Ze-jun,Jiang Yong-ping,Jiao Pei-rong,et al,The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses[J].J Virol,2006,80(22):11115-11123.

[8]Zhu Qi-yun,Yang Huan-liang,Chen Wei-ye,et al.A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens[J].J Virol,2007,82(1):220-228.

[9]冯华朋，钟功勋，张月梅，等.H5N1 亚型人禽流感病毒A/Anhui/2/2005 株反向遗传操作系统的建立[J].中国预防兽医学报，2010，32(2)：135-138.

[10]Zhou Bin,Li Yan,Belser J A,et al.NS-based live attenuated H1N1 pandemic vaccines protect mice and ferrets[J].Vaccine,2010,28(50):8015-8025.