鳜鱼传染性脾肾坏死病毒Taq Man 荧光定量PCR 检测方法的建立

安 伟，肖 雨，张崇文，张明辉，何正侃

(上海市水产研究所 上海市水生动物疫病预防控制中心，上海 200433)

2001 年我国首次从鳜鱼中分离到传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)[1]，并先后完成了病原病理研究[2]及病毒全基因组的测序工作[3]，该病毒属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属，其感染水生动物导致高发病率和高死亡率，给鳜鱼养殖业带来了严重的经济损失。因此,亟待建立一种快速、灵敏、特异的检测方法对病原进行及时诊断。

荧光定量PCR(qPCR)检测方法特异性强、灵敏度高、能够定量并且有效解决PCR 污染问题，已在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面广泛应用[4-6]。目前，尚未有应用qPCR 技术对ISKNV 进行检测的研究报道，本实验建立的检测ISKNV Taq-Man qPCR 方法，能够对ISKNV 进行定性和定量检测，对鳜鱼病原的诊断和防控具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 病 毒 ISKNV 由农业部渔业动植物病原库提供；流行性造血器官坏死病毒(EHNV)由连云港出入境检疫局动植物实验室提供；鲤春病毒血症病毒(SVC)由深圳出入境检疫局动植物实验室提供；草鱼呼肠孤病毒(GCRV)由中国检验检疫科学研究院动检所提供。

1.2 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶、PCR 反应液、pMD18-T 载体，探针法荧光定量试剂盒以及DNA提取试剂盒等均购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Axygen 公司。

1.3 引物及探针的设计与合成 根据GenBank 中ISKNV 基因组中 MCP 蛋白编码基因序列(AF371960)，应用Primer 5 软件设计一对引物和一条探针。序列为：F：5'-ATGCCAATCATCTTGTTG TAGCC-3'；R：5'-GGTGTCATTTAACGACCTGGT G-3'；Probe：5'-FAM-AGACCCTGACCACGAGTTCC TTGACTT-TAMARA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预期扩增的目的片段为142 bp。

1.4 重组质粒标准品的制备 按照DNA 基因组提取试剂盒说明提取的ISKNV 基因组为模板，应用特异性引物扩增MCP 基因部分片段。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，共35 个循环；72 ℃10 min。产物经2 %琼脂糖电泳检测。回收目的片段克隆于pMD18-T 载体中，构建重组质粒pMD-MCP，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

1.5 qPCR标准曲线的建立 对qPCR 反应体系、反应条件进行优化，参照试剂盒中20 μL 体系反应要求，筛选引物浓度以及退火温度等条件，以获得最低的Ct 值和较高的荧光强度增加值，提高实验结果的精准性。

根据测定重组质粒pMD-MCP 的OD260nm值，换算成质粒浓度，用双蒸水10 倍倍比稀释(1.95×108拷贝/μL～1.95×103拷贝/μL)，以其为模板，根据优化的最佳反应条件进行扩增，利用分析软件绘制标准曲线。

1.6 灵敏性试验 将重组质粒pMD-MCP 标准品10倍倍比稀释后(1.95×108拷贝/μL～1.95×10 拷贝/μL)进行qPCR 和普通PCR 反应，每个梯度浓度设3 个重复，以确定这2 种方法的检测下限，比较两种方法的灵敏性。

1.7 特异性试验 提取ISKNV、SVC、EHNV 和GCRV 的cDNA 或DNA 为模板，以建立的qPCR 方法进行特异性检测，同时设无模板对照。

1.8 重复性试验 将重组质粒pMD-MCP 标准品稀释3 个浓度梯度(1.95×103拷贝/μL，9.75×105拷贝/μL，1.95×106拷贝/μL，每个梯度设5 个重复，分成3 个批次(A，B，C)，进行批内和批间的重复性试验。

1.9 临床样品检测 采用建立的qPCR 方法，对2012 年上海地区收集的5 份不同养殖单位疑似患病鳜鱼进行ISKNV 检测，每份样品2 个重复，初步验证其应用效果。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备 经ISKNV 组织提取病毒DNA，进行PCR 扩增MCP 基因部分片段，得到约150 bp 产物(图1)。将目的基因克隆到质粒pMD18-T 中构建的重组质粒经测序与预期目的片段完全一致，命名为pMD-MCP。将其作为重组质粒标准品，提取的pMD-MCP 检测浓度为32.5 μg/mL。

2.2 qPCR标准曲线的建立 经优化qPCR 20 μL的反应体系：Premix Ex Taq(2×)为10 μL，上下游引物10 μmol/L 各0.4 μL，探针引物10 μmol/L 为0.3 μL，Rox 为0.4 μL，质粒模板1 μL，灭菌水7.5 μL。反应程序：95 ℃30 s、95 ℃5 s、62 ℃30 s，40 个循环；62 ℃进行荧光检测，每个梯度浓度设3 个重复。以10 倍倍比稀释的pMD-MCP 为模板进行qPCR，得到相应的标准曲线和动力学曲线(图2)。依据质粒拷贝数与Ct 值的线性关系，由7500 Software v2.0 软件得到标准曲线。其中横坐标代表质粒模板拷贝数，纵坐标为Ct 值，曲线方程为y=-3.213x+42.884。R=0.994，E=104.742%。

图1 重组质粒的鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid

图2 qPCR 的标准曲线和动力学曲线图Fig.2 Standerd and dynamic curves of qPCR

2.3 敏感性试验结果 通过对重组质粒pMD-MCP各稀释度样品进行qPCR 和普通PCR 检测。结果显示，该方法检测下限为20 拷贝/μL，Ct 值为34.99±0.15，而普通PCR 法的检测下限为1.95×104拷贝/μL(图3)。

图3 qPCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验Fig.3 Sensitivity tests of qPCR(A)and traditional PCR(B)

2.4 特异性试验结果 采用建立的qPCR 方法对ISKNV、SVCV、EHNV、GCRV 进行检测，结果表明仅ISHNV 病毒核酸有荧光信号，而其他病毒核酸均无荧光信号(图4)。

图4 ISKNV qPCR 特异性试验结果Fig.4 Specificity test of qPCR for ISKNV

2.5 重复性试验结果 根据重组质粒稀释不同的浓度和批次，进行数据和统计分析结果显示，批内和批间的变异系数均小于0.7 %(表1)。

2.6 临床病样的检测结果 将采集的5 份疑似病料样品分别利用建立的qPCR 和常规PCR 检测，结果显示，qPCR 能够检测5 份样品全部为阳性，而常规PCR 只能检测出其中的3 份样品为阳性。

表1 qPCR 检测ISKNV 批内及批间重复试验结果Table 1 Intra-and inter-batch reproducibility of qPCR assay for ISKNV

3 讨论

目前，解决ISKNV 感染传播的最有效办法是采取预防措施，即对病毒实行快速准确的检测预报。目前，应用常规PCR、套式PCR、qPCR 以及环介导的等温扩增等技术检测水生生物病毒已有相关报道[7-9]。其中，qPCR 技术优势明显，在重大疫情病原定量检测中广泛应用。

本研究通过设计并筛选出特异性的引物及探针，优化反应体系中引物、探针浓度及退火温度时间等反应条件，建立了ISKNV qPCR 的检测方法。其标准曲线线性关系良好，回归系数达到0.994，能够对病毒拷贝数精确定量检测，确定感染程度。灵敏度下限可达20 拷贝/μL，即可以检测到2.1×10-3pg/μL 的病毒核酸，比邓敏报道的常规PCR 方法灵敏度高出1 000 倍[10]。特异性强，与其他几种鱼类病毒病原无交叉反应，能够快速准确的进行定性分析。该方法的重复性好，批内和批间的变异系数均小于0.7 %，表明该检测体系稳定，适于大批量的病原样品检测。

采用建立的ISKNV qPCR 方法进行临床疑似病样的检测，结果与实际情况相符，并且敏感性高于普通PCR。该方法从病毒核酸提取到检测结果的完成只需1 h～2 h，显著提高了检测效率，适合在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫。

[1]He Jian-guo,Deng Min,Weng Shao-ping,et al.Complete genome analysis of the mandarin fish infectious spleen and kidney necrosis iridovirus[J].Virology,2001,291(1):126-139.

[2]吴淑勤，李新辉，潘厚军，等.鳜暴发性传染病病原研究[J].水产学报，1997，21(增刊)：56-60.

[3]何建国，翁少萍，黄志坚，等.鳜暴发流行病病毒性病原的研究[J].中山大学学报，1998，37(5)：74-77.

[4]Mackay I M,Arden K E,Nitsche A.Real-time PCR in Virology[J].Nucleic Acids Res,2002,30(6):1292-1305.

[5]Carli K T,Eyigor A.Real-time polymerase chain reaction for detection of Myeoplasma gallisepticum in chicken trachea[J].Avi Dis,2003,47(3):712-717.

[6]赵海玲，刘慧芳，杜艳芬，等.胎儿弯杆菌病Taq Man 实时荧光定量PCR 检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2009，31(11)：874-877.

[7]Jeong J B,Park K H,Kim H Y,et al.Multiplex PCR for the diagnosis of red sea bream iridovirus isolated in Korea[J].Aquaculture,2004,235(14):139-152.

[8]Chao Cha-ben,Chen Chun-yao,Lai Yue-ye,et al.Histological,ultra-structural,and in situ hybridization study on enlarged cells in grouper Epinephelus hybrids infected by grouper iridovirus in Taiwan(TGIV)[J].Dis Aquat Organ,2004,58(2-3):127-142.

[9]彭永刚，孙恩成，刘飞，等.环介导等温扩增技术在畜牧兽医领域的应用[J].中国兽医科学，2010，40(05)：543-546.

[10]邓敏，何建国，左涛，等.鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)PCR 检测方法的建立及虹彩病毒新证据[J].病毒学报，2000，16(4)：365-369.