鸡自然杀伤细胞的分离与免疫表型分析

杨 超，张晓娜，张园华，廉传江，文辉强，陈洪岩，韩凌霞*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队，黑龙江 哈尔滨 150001；2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

自然杀伤(Natural killer，NK)细胞是一类大颗粒淋巴细胞，具有先天性免疫细胞和适应性免疫细胞的特点[1]。因为未鉴定出鸡NK 细胞的特异性表面标记--哺乳动物NK 细胞的表面标记不适用于鸡NK 细胞，目前人们对鸡NK 细胞知之甚少。根据鸡胚免疫细胞的发育，14 日胚龄鸡胚脾脏中没有T细胞和B 细胞，是鸡NK 细胞最富集的区域，脾脏中的淋巴细胞曾经被命名为TCR0 细胞，后来被证明是鸡NK 细胞[2]。

鸡NK 细胞与多种禽病原体的致病性密切相关[3]。尽管国内对NK 细胞的研究逐渐增多，但基本集中于人和小鼠[4]，对鸡NK 细胞的系统研究比较少。本实验室参考国外最新研究进展，在国内首次建立了鸡NK 细胞的分离纯化方法，并通过形态学和免疫表型的研究证明成功分离培养及鉴定了鸡NK 细胞，为系统研究鸡NK 细胞奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 14 日胚龄SPF 鸡胚由本所实验动物中心提供。许可证编号为SCXK(黑)2011-007。

1.2 主要试剂和仪器 刀豆素A(ConA)购自Sigma公司，PE 标记的鼠抗鸡CD3(CT-3)、CD4(CT-4)、MHC Class I(F21-2)及FITC 标记的鼠抗鸡CD8a(CT-8)和Bu-1(AV20)等单克隆抗体(MAb)购自Southern Biotechnology 公司。鸡淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。IMDM 和鸡血清等购自GIBCO 公司，鸡重组白介素-2(rIL-2)购自Kingfisher 公司。30 ku 超滤管和FACS Aria 型流式细胞仪分别为MILLIPORE 和BD 公司产品。

1.3 条件培养基的制备 参照文献[5]的方法，无菌取健康成年鸡脾脏，300 目铜网研磨破碎，采用鸡血淋巴细胞分离液分离获得脾脏淋巴细胞，用PBS 洗3 遍，最后沉淀用IMDM 按浓度1×106/mL 重悬，在37 ℃5 % CO2培养2 h，按终浓度10 μg/mL加入ConA。培养48 h 收获细胞培养物，250 r/min离心5 min，将上清转移到30 ku 超滤管，3 000 r/min离心10 min，收获下层液体，即为条件培养液。分装，置-70 ℃备存。

1.4 鸡胚NK细胞的制备 无菌取30 枚14 日胚龄鸡胚脾脏，以PBS 冲洗，采用5 mL 含0.25 %胰酶的IMDM 溶液中，4 ℃消化12～16 h。弃胰酶消化液，加入1 mL 37 ℃预热的含0.25 %胰酶的IMDM继续消化。过量PBS 终止消化。利用鸡淋巴细胞分离液分离鸡胚脾脏淋巴细胞，PBS 洗3 次。沉淀按1×106/mL 加入完全培养基(10 %条件培养基，8 %FBS，2 %鸡血清，3 ng/mL rIL-2)。37 ℃5 % CO2培养48 h。收获悬浮细胞，暂时命名为TCR0 细胞。

1.5 瑞氏吉姆萨染色 按照瑞氏吉姆萨染色说明书染色。取1.4 中制备的1×105个细胞，PBS 洗2次，用100 μL 固定液(甲醇∶冰乙酸=1∶3)重悬，固定15 min。每张载玻片滴加50 μL，自然风干，蔡司光学显微镜(80×10 放大倍数)下观察记录。

1.6 鸡NK细胞免疫表型的流式细胞术分析 取1.4 中制备的鸡NK 细胞，台盼蓝溶液染色，血细胞技术法计算活细胞浓度，调整细胞浓度至1×106个/mL。PBS 洗2 次。取300 μL 细胞，分别加入1 μL PE 标记的CT-3、CT-4 和F21-2，以及FITC 标记的AV20 和CT-8，单染，同时将未加任何抗体标记的鸡NK 细胞作为阴性对照，相同处理。室温孵育30 min，过量PBS 终止反应，洗3 遍。最后加入300 μL PBS 重悬，立即通过FACS Aria 流式细胞仪检测。或加入300 μL 1 %多聚甲醛重悬，4 ℃固定。利用BD FACS Calibur 软件获取数据，采用Flowjo分析。

2 结果

2.1 鸡NK细胞的形态学鉴定 利用流式细胞仪检测培养的TCR0 细胞。流式前向角(Forward scatter,FSC)和侧向角(Side scatter，SSC)分析显示，TCR0细胞中85.1 %的细胞大小均一，胞内颗粒分布一致(图1)。瑞氏吉姆萨染色表明，分离的TCR0 细胞为大颗粒淋巴细胞，其中细胞核位于一侧，嗜酸性颗粒位于细胞内另一侧，符合NK 细胞特征(图2)。

2.2 鸡NK细胞免疫表型鉴定 采用流式细胞术和表型MAb 对TCR0 细胞染色。结果显示，TCR0 中，MHC I 高表达，占97.4 %，表明分离的细胞状态良好，表型完整；CD8a 低表达，占30.8 %；而T 细胞表面标记CD3 染色为阴性；B 细胞的标记CD4和Bu-1 染色均为阴性(图3)。实验结果表明，分离培养的TCR0 细胞状态良好，符合鸡NK 细胞标记特征。

图1 流式细胞术FSC &SSC 分析TCR0 细胞Fig.1 The FAS &SSC analysis of cultured chicken NK cells

图2 TCR0 细胞的瑞氏吉姆萨染色Fig.2 The Wright-Giemsa staining of the isolated cells

图3 TCR0 的免疫表型特征鉴定Fig.3 The immunophenotypic analysis of the TCR0 cells by Cytometry

3 讨论

流式前向角散射与被测细胞大小相关，而侧向角与胞内颗粒型相关。在本实验中，前向角和侧向角分析显示，在TCR0 细胞中，高达85.1 %的细胞大小均一，颗粒型一致。表明冷胰酶法分离鸡胚脾脏细胞和培养纯化方法可行。瑞氏吉姆萨染色染色显示TCR0 细胞的形态学符合NK 细胞特征[6]。

本实验结合国外的免疫表型研究进展对收获的鸡NK 细胞进行了免疫表型分析。Gobel 等研究显示鸡NK 细胞表面不表达CD3，10%低表达CD8α[7]。Zhang 等研究表明纯化的鸡NK 细胞微量表达Bu-1[8]，Jeason 等研究显示鸡NK 细胞不表达CD4[9]，本实验结果与上述研究结果基本相符。

总之，本实验通过对鸡NK 细胞形态学和免疫表型2 个方面的鉴定，证明已成功建立了鸡NK 细胞的分离培养方法，为深入研究鸡NK 细胞奠定了基础。

[1]杨超，韩凌霞，陈洪岩.自然杀伤细胞受体与功能的研究进展[J].实验动物科学，2013(05)：55-58.

[2]Pat B R,Chen C I H.Development of cytoplasmic CD3+/T cell receptor negative cells in the peripheral lymphoid tissues of chickens[J].Eur J Immunol,1990,20(6):1345-1350.

[3]Jansen C A,de Geus E D,van Haarlem D A,et al.Differential lung NK cell responses in avian influenza virus infected chickens correlate with pathogenicity[J].Scientific reports,2013,3:1-10.

[4]黄湛.CD226～+NK 细胞参与系统性红斑狼疮疾病进程[D].合肥：中国科学技术大学，2011.

[5]Gobel T W.Isolation and analysis of natural killer cells in chickens[M].Natural Killer Cell Protocols.Springer,2000:337-345.

[6]Campell K S.Natural killer cell protocols:cellular &molecular methods[M].Methods in Molecular Biology,2 ed,Humana Press,2011.

[7]Gobel T W,Chen C L H,Shrimpf J,et al.Characterization of avian natural killer cells and their intracellular CD3 protein complex[J].Eur J Immunol,1994,24(7):1685-1691.

[8]Zhang Lei,Katselis G S,Moore R E,et al.MHC class I target recognition,immunophenotypes and proteomic profiles of natural killer cells within the spleens of day-14 chick embryos[J].Devel Comp Immunol,2012,37(3):446-456.

[9]Jansen C A,van de Haar P M,van Haarlem D,et al.Identification of new populations of chicken natural killer(NK)cells[J].Devel Comp Immunol,2010,34(7):759-767.