HPLC-ELSD测定得力生注射液的黄芪甲苷的含量

罗丹，罗国安，陈丽，马晋芳，王义明

得力生注射液是抗肿瘤药物，是由红参、黄芪、蟾酥和斑蝥4味中药组成的复方静脉注射液，具有益气化瘀、软坚散结之功效，能促进肿瘤细胞凋亡及再分化，抑制多种肿瘤细胞生长，对放疗和化疗不敏感的腺型癌细胞也有很强的抑制作用和显著的镇痛作用，还可清除体内自由基，显著提高机体的免疫功能[1,2]。

关于得力生注射液质量标准的研究，目前仅见关于其中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的相关报道[3]。然而，国家药品监督管理局颁布的《中药注射剂安全性再评价质量控制评价技术原则（试行）》中明确规定：“多成份制成的注射剂应分别采用专属性的方法（如HPLC和/或GC等定量方法）测定各主要结构类型成份中至少一种代表性成份的含量，其中含量测定指标成分的选择应包括大类成分和单一成分的含量测定。在对得力生注射液质量标准的系统研究中，我们已建立了得力生注射液中单糖及蔗糖含量的测定方法[4]。得力生注射液中配伍药材黄芪具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血等功效，为扶正补虚之要药，现代研究表明，黄芪中主要活性成分黄芪甲苷具有调节机体免疫功能、保护肾上腺皮质和骨髓功能的效应[5,6]。本文用HPLCELSD建立了得力生注射液中黄芪甲苷的含量测定方法，为产品质量的提高提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1100系列高效液相色谱仪（配备二元泵，柱温箱等；Agilent公司）；Alltech2000蒸发光散射检测器（Alltech公司），浙江大学N2000色谱工作站；超纯水仪（Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统）；XP205型电子天平（d=0.01mg；瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功500W，频率40KHz)。

乙腈（色谱纯，fisher公司）， 超纯水（Milli Q Synthesis 超纯水纯化系统制， 过0.2μm 微孔滤膜）；正丁醇、氨水、乙醇等其他试剂均为分析纯；D101型大孔吸附树脂（天津海光化工有限公司生产）。

黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110808-200508，含量测定用，纯度大于98%）。得力生注射液模型制剂按工艺制备，得力生注射液（批号：101101，101102，101103）及各配伍药材均由山东正邦制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltech AlltimaC18（4.6×250 mm, 5 μm）；流动相：乙腈-水（32∶68）；流速：1 mL．min-1；柱温：30℃；蒸发光散射检测器（干燥气流速2.7 L．min-1；漂移管温度100℃）；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1.3 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取得力生注射液100 mL，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用95%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45 μm滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方量制备缺黄芪药材的得力生注射液样品，按“2.2.2”项下制备成阴性对照液。

2.3 干扰实验

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液、得力生注射液供试品溶液、阴性对照液各20 μL，分别注入液相色谱仪，在“2.1”色谱条件下测定，记录色谱图（见图1）。在得力生注射液供试液色谱图中，与对照品色谱图相应位置（tR=26.0 min）上，确认了黄芪甲苷色谱峰，而阴性对照液色谱图无黄芪甲苷的色谱峰，故认为无干扰。

图1 高效液相色谱图A.标准品；B.药材；C.提取液；D.注射液；1.黄芪甲苷

2.4 线性关系考察

将“2.2.1”黄芪甲苷对照品配制成质量浓度分别为0.065 mg．mL-1，0.262 mg．mL-1，0.524 mg．mL-1，0.786 mg．mL-1，1.048 mg．mL-1，1.310 mg．mL-1的系列浓度对照品溶液，在“2.1”色谱条件下测定，以对照品质量浓度（mg．mL-1）的对数为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程为Y=1.5615X+4.5659，相关系数：r=0.9993（n=6），表明在0.065～1.310 mg．mL-1之间呈良好的线性关系。

2.5 最低定量限及检测限

采用信噪比法检测黄芪甲苷的检测限及定量限。以信噪比为3∶1时相应浓度确定其检测限，以信噪比为10∶1时相应浓度确定其定量限。将黄芪甲苷对照品溶液稀释一定倍数，分别自动进样20 μL，得到黄芪甲苷的检出限及定量限。检测限为：0.434 μg。定量限为：1.300 μg。

2.6 精密度实验

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液，按“2.1”色谱条件连续测定6次， 记录峰面积，测得黄芪甲苷的精密度（RSD）为0.14%，表明精密度良好。

2.7 重复性实验

精密量取得力生注射液，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法制备6份得力生注射液供试品溶液，按“2.1”色谱条件依次测定，记录色谱峰峰面积，测得黄芪甲苷峰面积的RSD为3.47%（n=6），结果表明方法重现性良好。

2.8 稳定性实验

分别精密吸取室温下放置的得力生注射液供试品溶液，分别在配制后0，2，4，6，8和12 h，按“2.1”色谱条件进样分析，测定黄芪甲苷峰面积，计算RSD为3.12%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率实验

精密量取已知含量的得力生注射液50 mL，共9份，按80%，100%，150% 3个目标浓度，分别精密加入黄芪甲苷对照品适量，每一质量浓度取3份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，计算平均回收率为100.1%，RSD为3.7%。结果见表1。

表1 回收率实验结果 (n=9)

2.10 样品测定

取3批得力生注射液供试品溶液各20 μL，采用“2.1”色谱条件进样分析，测定黄芪甲苷的含量。结果表明，3批得力生注射液（批号101101，101102，101103）中黄芪甲苷的含量分别为12.84 μg．mL-1、12.58 μg．mL-1、16.12 μg．mL-1。

3 讨论

黄芪甲苷为得力生注射液中黄芪扶正祛邪，调节机体免疫功能的主要活性成分。本研究建立了该成分含量测定方法，方法简便、准确、灵敏度高，能够有效控制该制剂质量。

鉴于黄芪甲苷的紫外最大吸收波长在200 nm ，属有末端吸收[8]，故本研究采用HPLC-ELSD测定黄芪甲苷的含量。通过对蒸发光检测器温度和载气流量等考察，当检测器温度100℃；载气流量：2.7 L．mL-1黄芪皂苷的响应值较好，并且有较好的分离度。同时对不同流动相体系甲醇-水、乙腈-水，及不同流动相比例进行考察，确定乙腈-水（32∶68）为流动相具有较好的分离度。

由于得力生注射液由红参、黄芪、蟾酥和斑蝥四味药材提取物制成，干扰成分较多。目前尚未见得力生注射液中黄芪甲苷的含量测定方法。本研究对黄芪甲苷的富集方法进行优化。采用大孔树脂法、水饱和正丁醇萃取法和SPE固相萃取法分别制备供试品溶液，结果表明，3种方法测定结果均无统计学差异。在获得较好实验结果的前提下，考虑到方法重现性、检测成本等因素，最终采用大孔吸附树脂法富集得力生注射液中黄芪甲苷。对大孔树脂类型和洗脱梯度进行考察，确定D101型大孔吸附树脂柱，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用95%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解。这一前处理方法可有效去除极性成分，糖类等的干扰，实现黄芪甲苷准确定量。

[1] 刘建新,路华,张玉珍,等.得力生联合化疗的体外抗癌活性[J].河北医科大学学报, 2001, 22(5): 294.

[2] 孙建海,马燕凌,彭明娥.化学治疗联合得力生注射液治疗中晚期恶性肿瘤102例[J].医药导报, 2006, 25(6): 523.

[3] 高祥祥,张文婷,李秀玲,等.HPLC测定得力生注射液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].2006,11(28): 1709.

[4] 马晋芳,陈丽,谢媛媛,等. HPLC-ELSD同时测定得力生注射液中单糖及蔗糖含量[J].药物分析杂志,2012, 32(6): 998.

[5] 牛嵩山.黄芪甲苷的药理研究进展[J].国医论坛, 2012, 27(4): 53.[6] 陈信义,雒琳.得力生注射液组方科学依据与临床应用前景分析[J].现代肿瘤医学,2006,14(37):378.