星点设计-效应面法优化甘草总黄酮骨架缓释片处方

余琳，李小芳，冉茂莲，罗丹，罗丽佳，李培培

甘草总黄酮为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎的提取物，甘草味甘、平，归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛等[1]。现代药理学研究发现甘草总黄酮具有明显的抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、镇痛抗炎、免疫调节、保肝、抗抑郁等作用[2]。果嘉等对甘草总黄酮的抗抑郁作用进行了研究，结果表明甘草总黄酮具有抗大鼠慢性不可预测温和应激模型引起的行为抑郁作用，无中枢兴奋的不良反应，并且在较大剂量下能对应激引起的海马神经再生损害起到保护作用，甘草苷的抗抑郁作用与单胺类神经递质有关，可在一定程度上恢复HPA轴功能，增强免疫功能[3]，同时甘草总黄酮的镇痛抗炎、免疫调节及保肝作用等可间接治疗抑郁症，甘草总黄酮在抑郁症治疗方面具有良好的发展前景。

1 材料与仪器

UV-6100紫外可见分光光度仪（上海美谱达仪器有限公司 ）； RE-2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)； BP211D AG 型电子天平( 德国 Satorius)，UPT-I-10T 型超纯水器( 成都超纯科技有限公司)；DZG- 6020 型真空干燥箱( 上海森信实验仪器有限公司)；ZRS-8G 智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）；85-2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；甘草苷对照品（批号：MUST-12082414）：购自曼斯特生物科技有限公司，甘草总黄酮(购自西安小草植物科技有限责任公司，纯度为90%)，聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVPK30成都市科龙化工试剂厂），PEG4000、HPMCK4M（成都科龙化工试剂厂）。

2 实验方法与结果

2.1 甘草总黄酮骨架缓释片的制备

原、辅料过100目筛，准确称取处方量的甘草总黄酮、HPMC K4M、PVP K30，用适量的乙醇溶解后，加入熔融的PEG4000中，搅拌挥去乙醇，干燥后粉碎，与填充剂混匀后加入适量润滑剂，压片即可，片子硬度控制在4～6 kg，片重约300 mg，每片含药量约75 mg。

2.2 甘草总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 精密称取甘草苷对照品适量，用含1.0%十二烷基硫酸钠（SDS）的pH6.8磷酸盐缓冲液配制成0.1 g．L-1的对照品溶液即可。取不同时间点的溶出液10 mL，过0.45 μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密移取“2.2.1”项下对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的10%KOH溶液显色5 min，乙醇定容至刻度，在最大吸收波长337 nm处测定吸光度, 绘制标准曲线，甘草苷在5.0～30.0 μg．mL-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为:Y=0.0275X+0.077（r=0.9995）。

2.3 溶出度测定

按照2010版中国药典（二部）附录XC溶出度测定的第二法桨法，以1000 mL pH6.8磷酸盐缓冲液为溶出介质，转速为100 rpm进行测定，温度（37±0.5℃），分别于1,2,4,6,8,10,12 h各取样10 mL （同时补加10 mL等温溶出介质），经 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取5 mL显色后定容至10 mL，在337 nm波长处测定吸光度，计算累积释放百分率。

2.4 单因素试验及结果

通过单因素试验对HPMC规格、填充剂及润滑剂进行了筛选，结果HPMC K15M和HPMC K100M为缓释材料，药物前期释放较缓慢，且释放不完全，因此选择HPMC K4M为缓释材料。考察了微晶纤维素、乳糖和可溶性淀粉对药物体外释放的影响，三种填充剂对药物的体外释放影响较小，微晶纤维素用量较大时，会出现前期释放较快的现象，因此选择乳糖为填充剂。考察了滑石粉、硬脂酸镁和微粉硅胶三种润滑剂对药物体外释放的影响，结果其影响较小，以1%硬脂酸镁为润滑剂制得的片子表面光滑，最终选择硬脂酸镁为润滑剂。

2.5 星点实验设计

根据处方设计，以HPMC K4M含量、PVP K30含量及PEG4000含量为自变量，以2，6，10 h药物累积溶出率的综合评分Y值为因变量，每个因素设 5 水平，用代码－α、－1、0、1、α来表示， 因素水平见表1。

表1 星点设计因素水平表

2.6 试验结果及效应面优化

2.6.1 综合评分Y值的计算 根据《中国药典》2010版有关规定确定处方释药标准为：①缓释片释药初期，即在1～2 h内，其累积释放度应达到20%～30%，用以考察缓释片是否有突释；②缓释片释药中期，即在4～6 h内，其累积释放度应达到40～70%，用以确定缓释片的释药特性；③缓释片释药后期，即8～12 h内，其累积释放度应达到80～100%，用以考察缓释片释药是否完全。参考文献[4]，设计综合评分Y值为筛选指标，即Y=Q10-[（Q2-30）2+（Q6-50）2]1/2，其中[（Q2-30）2+（Q6-50）2]1/2反映了2、6 h释放度的偏差，值越小越好，10 h的释放量应大于80%，Q10应越大越好，因此综合评分Y值应越大越好。

2.6.2 模型拟合 以综合评分Y值为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，使用Design-Expert软件拟合模型。

多元线性回归方程为：

Y=68.461-1.646X1+0.148X2+2.360X3（P=0.08＞0.05，r=0.5798）。

二项式拟合方程为：

Y=-51.891+9.272X1-0.152X2+8.584X3-0.014X1X2+0.167X1X3+0.392X2X3-0.306X12-0.068X22-0.968X32（P=0.0002＜0.01，r=0.9604）。

试验结果、方差分析见表2、3，结果显示该模型具有高度的显著性，方差的可信度及拟合度均较好，故可用此模型对甘草总黄酮缓释片的处方进行预测和分析。

表2 星点试验设计及结果

表3 甘草总黄酮缓释片制备工艺方差分析

2.6.3 工艺优化与预测 最优处方：HPMC K4M占处方量15.42%，PVP K30 占处方量32.65%，PEG4000占处方量14.65%，预测综合评分Y值为81.41。效应面图如下：

图1 PVP K30和HPMC含量对Y值的影响

图2 PEG4000和HPMC含量对Y值的影响

图3 PEG4000和PVP K30含量对Y值的影响

2.6.4 验证实验 根据效应面优化的最佳处方进行3批药物溶出验证实验，3批验证实验的综合评分Y值分别为79.91、79.33、80.44，平均值为79.89，二项式拟合方程预测值与实测值的偏差为1.61%，[偏差=(预测值-实测值) /预测值×100 % ] ，说明二项式拟合效果良好，可信度高，结果见表4。

表4 三批验证实验结果

2.7 甘草总黄酮体外释药模型拟合

分别以零级、一级和Higuchi方程对甘草总黄酮缓释片的体外释药过程进行模型拟合，结果表明甘草总黄酮缓释片的体外释药符合Higuchi方程，释药机理为溶蚀和扩散相结合，以溶蚀释药为主，实验结果见表5。

表5 甘草总黄酮缓释片释药模型拟合

3 讨论

临床常用的抗抑郁药物以西药为主，长期服用副作用较大，患者顺应性差，因此从天然产物中寻找低毒高效的抗抑郁药物是本领域的研究热点。甘草总黄酮日服剂量较大，将其制备成缓释片，可减少服药次数。甘草总黄酮在水中的润湿性及溶解性很差，制备缓释片时药物难以溶出，因此有必要采取相应的增溶手段增加药物的溶出，以确保药物释放完全，同时提高其体内生物利用度。

在固体制剂中，目前对难溶性药物的增溶方式主要有环糊精包合及固体分散，本课题预实验考察了PVP K30、PEG4000、PEG6000及泊洛沙姆188对甘草总黄酮的增溶作用，四种载体均能不同程度的增加甘草总黄酮的溶解率，其中PVPK30和泊洛沙姆188的增溶作用较好，但泊洛沙姆制得的固体分散体不易干燥，且片剂制备较困难，PEG4000和PEG6000单独使用，遇药物黏性也较大，干燥成型困难，而PVPK30吸湿性较大，同时制得的固体分散体易出现老化现象，因此选用PVP K30和PEG4000为联合载体，低黏度的HPMC K4M也常被用于难溶性药物固体分散体的制备，其具有一定的抑晶作用，其亲水凝胶性能可使药物达到一定的缓释效果。多种载体联合使用制备固体分散体改善难溶性药物的溶解性，可互相弥补单一载体存在的不足，目前在固体分散体的制备中应用较多。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:80.

[2] 田庆来,官月平,张波,等.甘草有效成分的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发,2006,14:343.

[3] 果嘉,赵伟鸿,樊紫周,等.甘草总黄酮抗抑郁作用研究[J].中药药理与临床,2012,28(6):59.

[4] 向军涛,蒋琳兰.硝苯地平缓释片的制备及其体外释放度考察[J].中国药房,2007,18(7):526.