藏药小檗花的质量标准研究

李艳，杜蕾蕾，张小灵，刘川，赖先荣，张艺，范刚

小檗花，藏药名为“杰唯美多”、“吉嘎尔梅朵”等，收载于《四部医典》、《晶珠本草》、《中国藏药•第三卷》、《中华藏本草》等藏医药著作[1～4]。藏药小檗花味甘、性凉，具有解毒、止泻、利湿、干黄水、止血、消炎等功效，常用于治疗热泻、瘟疫、陈旧热、出血症等[1～4]。目前，小檗花药材的化学成分及质量评价研究报道甚少，仅1991 年Sivakumar等[5]从小檗科小檗属植物Berberis aristata花中分离得到绿原酸、咖啡酸、槲皮素、芦丁和腊梅苷等成分，但国内外未见这些成分的含量测定和药材质量标准研究报道。为了提高小檗花药材的质量控制水平，本文根据《中国药典》质量标准研究制定技术要求，对小檗花药材进行了显微鉴别、薄层鉴别研究，测定了水分、总灰分、酸不溶性灰分含量，同时采用HPLC法测定了有效成分绿原酸的含量，为其开发利用和质量控制提供了科学依据。

1 仪器与试药

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，配备二极管阵列（DAD）检测器、自动进样器和柱温箱；DHG-9023A型电热鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；Sartorius BP121s电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；2.5-12型箱式电阻炉（沈阳市节能电炉厂）；ULUP-I-10T优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；CQ-250超声波清洗器（上海必能信有限公司）。

绿原酸对照品（批号：110781-200512，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所，使用前置干燥器中干燥至恒重。乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。本文共收集了5批小檗花药材，经成都中医药大学贾敏如教授鉴定其为小檗科植物金花小檗Berberis wilsonaeHemsl.和刺黄花Berberis polyanthaHemsl.的干燥花及花蕾，药材来源见表2。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取5批小檗花药材样品，分别粉碎，照显微鉴别法（《中国药典》2010年版一部附录ⅡC），观察其粉末的显微特征。本品粉末黄棕色至棕色。花粉粒淡黄色，呈圆球形、类圆形，直径40～50 μm，表面有点状雕纹。萼片表皮细胞表面观类多角形或稍不规则，壁薄，较平直。花冠表皮细胞类长圆形或类多角形，垂周壁薄，较平直，含多数淡黄色物，花冠裂片顶端表皮细胞外壁突起呈短绒毛状。柱头及花柱上部表皮细胞分化成圆锥形单细胞毛，先端尖或稍钝。花粉囊内壁细胞表面观呈长圆形，具网状或不规则螺旋状增厚。导管为梯纹、螺纹，直径15～40 μm。见图1。

图1 小檗花药材粉末显微特征图

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.2.3 薄层色谱条件及结果 照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液2 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在105 ℃加热数分钟，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2。

图2 小檗花的TLC图

2.3 检查

水分测定按照《中国药典》2010年版一部附录IX H第一法测定，总灰分、酸不溶性灰分按照《中国药典》2010年版一部附录IX K方法测定，结果见表2。

2.4 绿原酸的HPLC含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 × 4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），检测波长：327 nm，流速：1.0 mL．min-1，柱温：30℃，进样量：10 μL，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于5000。

2.4.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含90 μg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系的考察 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.40 mg的对照品贮备溶液。分别精密吸取对照品贮备溶液1.35，1.80，2.25，3.75，7.50，15.00 mL至不同的10 mL量瓶中，加甲醇制成不同浓度的绿原酸对照品溶液。精密吸取绿原酸对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。以绿原酸峰面积值为纵坐标，浓度（mg．mL-1）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y = 32912 X - 110.83（r = 0.9999），绿原酸在0.054～0.600 mg．mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液（0.09 mg．mL-1）10 μL，连续进样5次，记录峰面积，结果绿原酸峰面积的RSD为0.18%，表明精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 分别精密吸取绿原酸对照品溶液（0.09 mg．mL-1）各10 μL，于0，1，2，4，12，24 h分别注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积，其RSD为0.13%，表明对照品溶液在24小时内稳定。

2.4.7 重复性试验 取同一批样品（批号：2013071702）粉末约0.2 g，共6份，精密称定，按上述供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液。在上述色谱条件下，依法测定，计算绿原酸的含量。结果，本批药材中绿原酸的平均含量为0.45%，RSD为1.61%，表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取同一批（批号：2013071702）已知含量的小檗花样品粉末9份，每份约0.1 g，精密称定，分别按已知含量的80%，100%，120%三个水平加入绿原酸对照品，再按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定绿原酸的含量，计算回收率，见表1。结果绿原酸的加样回收率在95～105%之间，平均回收率为98.75%，RSD为1.22%。

表1 绿原酸加样回收率试验结果

2.4.9 样品含量测定 取不同批次的小檗花药材样品，平行2份，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定绿原酸的含量。对照品及供试品的HPLC图谱见图3，含量测定结果见表2。

图3 对照品（A）和供试品（B）的HPLC图谱（1.绿原酸）

表2 小檗花药材检查项及绿原酸含量测定结果（n = 2）

从表2可知，5批药材中绿原酸的含量在0.44%～2.64%之间，不同品种的小檗花药材绿原酸含量差异较大，金花小檗的绿原酸含量平均值为0.60%，刺黄花的绿原酸含量平均值为2.52%，不同的植物物种由于遗传背景差异而影响了化学成分的合成与积累。课题组前期调查发现，藏医临床所使用的小檗花药材的“基源”十分混乱，小檗属多个品种均可入药。根据本文的研究结果，今后应密切注意不同品种小檗花药材的疗效差异。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

小檗花主要含有酚酸（绿原酸、咖啡酸）及黄酮类（槲皮素、芦丁、腊梅苷）成分[5]，本实验采用HPLC-DAD法，通过对照品对照，并比对紫外吸收图谱，发现小檗花药材中含有较高含量的绿原酸，而咖啡酸、芦丁、槲皮素等成分含量甚微。现代研究表明，绿原酸具有明显的抗菌、抗病毒作用，并能缩短凝血及出血时间[6～8]，这与藏医用小檗花治疗泻痢、失血等症相吻合。因此，本文选择绿原酸作为小檗花药材的薄层鉴别及含量测定的指标性成分是合理的。

3.2 薄层鉴别条件的考察

本文考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）、乙酸乙酯-甲酸-乙醇（7∶2∶1）、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）等溶剂系统，结果乙酸丁酯-甲酸-水溶剂系统展开效果最佳。考察了供试品溶液不同的点样量（1, 2, 3, 5 μL），结果发现点样量为2 μL时，绿原酸斑点圆整、清晰。另外，本文还考察了不同薄层板、温度、湿度等条件对薄层展开的影响程度，结果不同的薄层板、温度和湿度对展开结果没有影响，绿原酸均能得到很好的分离，说明建立的薄层鉴别方法的耐用性较好。

3.3 绿原酸HPLC含量测定条件的考察

目前，小檗花中绿原酸的HPLC含量测定未见报道，本文参考《中国药典》2010版一部“金银花”、“杜仲叶”药材中绿原酸HPLC含量测定方法，通过大量实验，确定了最佳的HPLC色谱条件。在供试品溶液制备时，考察了甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇溶剂的提取效率，结果70%甲醇的提取效果最佳；考察了超声、冷浸、水浴回流3种不同提取方法，结果超声提取比回流、冷浸提取的效率更高。此外，本文还对超声时间、提取次数、溶剂用量等参数进行了单因素考察，最终确定了最优的供试品溶液制备方法。

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