益母草倍半萜化合物对大鼠凝血功能和子宫活动的影响

李梦婷，代良萍，彭尧，熊亮,2，骆华刚，谢晓芳,2

益母草为唇形科植物益母草Leonurus JaponicusHoutt.的新鲜或干燥地上全草，作为“上品”始载于《神农本草经》，味辛、苦、微寒，归心、肝、膀胱经，具有祛瘀生新、活血调经的功效，是妇科常用药物。目前市场以益母草开发的妇科中成药，如益母草膏、益母草颗粒、益母草注射液等，均有良好的临床疗效。现代药理研究表明，益母草具有双向调节子宫活动、防止血小板聚集作用[1]，但物质基础不明。课题组在前期研究中首次从益母草中提取分离到倍半萜化合物，本课题初步研究其对子宫活动和凝血功能的影响，以探讨益母草调经活血的物质基础。

1 材料

1.1 药物

Chamigrenal(以下简写为YMC-4)、(2S,5S)-2-hydroxy-2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-en-8-one（以下简写为YMC-6），由成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地中药化学实验室从益母草药材中提取得到，经HPLC、核磁共振技术等鉴定[2]，纯度达99%以上。实验前均用二甲基亚砜（DMSO）配置成1×10-2moL．L-1的贮备液，临用前以去离子水稀释成1×10-3moL．L-1使用。

1.2 动物

SD大鼠，清洁级，雌雄不拘（做子宫试验者为全雌），体重200～240g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，质量合格证号：SCXK（川）2008-11。

1.3 试剂与仪器

二磷酸腺苷二钠（ADP，美国sigma公司，批号SLBB1854V，临用前去离子水配成0.5mg．mL-1），二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司），PT、aPTT、TT、Fbg试剂盒（德国Siemens 公司，批号分别为545487、547163A、42282、538043），缩宫素注射液（河南辅仁怀庆堂制药有限公司，批号：1204021），NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、葡萄糖（均由成都市科龙化工试剂公司生产，用于配制洛氏液，配制方法：1000 mL含NaCl 9.2 g、KC1 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g）。多通道血小板聚集仪（APACT/2型，德国兰波），全自动血凝仪（CA-530 系列，日本Sysmex公司），十六道生理记录系统（P13516型，澳大利亚Powerlab公司)，离体组织灌流系统（ML0186型，澳大利亚Powerlab公司）。

2 实验方法

2.1 体外血小板聚集试验

报道[3]，选用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后，股动脉采血，以3.8%枸椽酸钠与血液1∶9抗凝，800 r．min-1离心10 min制备富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP），剩余部分以3000 r．min-1离心10 min制备贫血小板血浆（plateletpoor plasma,PPP），以血球计数仪测定血小板浓度调整至血小板含量为200～300×109个/L。以PPP调零，取200 μL PRP加入比浊管中37℃温育5 min，加入20 μL受试药物溶液，使得YMC-4、YMC-6的终浓度均为1×10-5moL．L-1，空白组加入1%DMSO溶液。混匀后继续温育5 min，然后加入ADP20 μL（终浓度为0.05 mg．mL-1）诱导聚集。用血小板聚集仪测定5 min内血小板最大聚集率（%）。

2.2 体外凝血试验

参考文献报道[3]，选用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后，股动脉采血，以3.8%枸椽酸钠与血液1∶9抗凝，以3500 r．min-1离心10min，收集血浆，按200 μL/管加入到样品管中，并加入1×10-3moL．L-1的YMC-6药液（药物终浓度为1×10-5moL．L-1），混匀后温育5 min，然后采用全自动血凝仪测定PT、aPTT、TT。

2.3 大鼠子宫活动试验

分别观察两个倍半萜化合物对非痉挛子宫和痉挛子宫的影响。取健康、成年雌性未孕大鼠，实验前2日每日灌胃戊酸雌二醇片16.7 mg．kg-1以造成动情期。参考文献制备离体子宫[4]，于第3日颈椎脱臼处死动物，迅速剪开腹腔剖取子宫置于盛有洛氏液的玻璃皿，轻轻剥离子宫上附着的结缔组织和脂肪组织，取中间段2～3 cm，一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽，另一端连接张力换能器，浴槽为（37±0.5）℃，并通以（95% O2+5% CO2）的混合气体，速度1～2个小气泡/s，前负荷1g。用十六通道生理记录系统记录子宫收缩曲线。待曲线稳定30 min后开始加药，采用累加给药方式给予1×10-3moL．L-1的YMC-4、YMC-6，给药剂量为20 μL、20 μL、40 μL（即YMC-4和YMC-6的低、中、高剂量终浓度均为1.0×10-7moL．L-1、2.0×10-7moL．L-1、4.0×10-7moL．L-1），以相当于相同浓度的DMSO溶液（浓度为1.41×10-5moL．L-1、2.82×10-5moL．L-1、5.63×10-5moL．L-1）为溶剂对照组。每次加药后记录10 min子宫活动后再续加第2次、第3次，3次加完后用洛氏液冲洗3次，待曲线稳定后，开始下一次给药。大鼠痉挛性子宫试验时，在给药前先加入1U．mL-1缩宫素160 μL（终浓度为0.008U．mL-1）使子宫痉挛，记录曲线10 min后，再加入80 μL YMC-4或YMC-6。以给药前为基础值，计算给药后或者造模后药物对子宫收缩幅度（最大值、最小值、平均值）、频率和活动力的抑制率或兴奋率（Δt），观察药物对正常状态下和痉挛状态下大鼠子宫活动的影响。子宫活动力、Δt计算方法：

子宫活动力=平均值×频率

抑制率：Δt=（给药前-给药后）/给药前×100%

兴奋率：Δt=（造模后或给药后-造模前）/造模前×100%

2.4 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件建立数据库，两组间比较用独立样本t检验，多组间的比较以单因素方差分析（one-way ANOVA）统计，结果以（x±s）表示，P＜ 0.05 为显著性差异。

3 实验结果

3.1 对血小板聚集率和体外凝血功能的影响

结果显示，YMC-6在终浓度为1×10-5moL．L-1时，能明显降低ADP诱导的体外大鼠血小板最大聚集率，缩短体外凝血时间PT，与溶剂对照组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且有延长PT、aPTT的趋势。由于YMC-4得率少，未进行体外凝血功能测定，而对ADP诱导的血小板聚集率无明显影响。结果见表1、2。

表1 YMC-6对体外血小板聚集和凝血功能的影响（±s）

表1 YMC-6对体外血小板聚集和凝血功能的影响（±s）

注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量 聚集率 PT aPTT TT（moL．L-1） （%） （s） （s） （s）溶剂对照 — 61.4±9.44 16.1±1.65 17.2±2.29 21.2±4.04 YMC-6 1×10-5 42.0±15.63** 16.2±1.79* 18.3±2.10 22.0±4.38

表2 YMC-4对ADP诱导的体外血小板聚集功能的影响（±s）

表2 YMC-4对ADP诱导的体外血小板聚集功能的影响（±s）

组别 剂量 样本量 聚集率（moL．L-1） （N） （%）溶剂对照 — 10 44.2±12.2 YMC-4 1×10-5 10 43.9±12.3

3.2 对大鼠离体子宫活动的影响

由表3～表7可见，DMSO作为溶剂对大鼠离体子宫活动有抑制作用，随着剂量的加大，其收缩幅度（最大值、最小值、平均值）和活动力的抑制率均逐渐增大，对收缩频率影响不大；与给药前比较，YMC-4、YMC-6也对大鼠离体子宫收缩幅度（最大值、最小值、平均值）和活动力呈抑制作用，但与溶剂对照组比较，YMC-4、YMC-6对收缩幅度平均值、频率和活动力的抑制率较DMSO更明显，但均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩最大值变化率的影响(±s)

表3 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩最大值变化率的影响(±s)

组别 N 给药前 Δt（%）（g） 低剂量 中剂量 高剂量DMSO 10 3.71±1.23 3.05±3.16 5.78±5.05 21.92±24.06 YMC-6 10 4.25±1.18 2.36±3.86 0.66±27.34 14.30±11.05 YMC-4 10 4.16±0.97 3.23±18.37 15.07±22.26 13.36±24.74

表4 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩最小值变化率的影响(±s)

表4 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩最小值变化率的影响(±s)

组别 N 给药前 Δt（%）（g） 低剂量 中剂量 高剂量DMSO 10 0.53±0.14 3.24±4.76 2.62±4.61 5.76±6.34 YMC-6 10 0.62±0.21 2.05±4.83 5.59±6.27 7.77±6.88 YMC-4 10 0.58±0.24 4.02±9.07 0.13±13.94 8.25±22.42

表5 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩平均值变化率的影响(±s)

表5 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩平均值变化率的影响(±s)

组别 N 给药前 Δt（%）（g） 低剂量 中剂量 高剂量DMSO 10 1.24±0.31 2.88±7.52 5.45±6.05 15.34±9.31 YMC-6 10 1.68±0.62 8.97±6.62 12.30±7.68 17.39±10.21 YMC-4 10 1.63±0.72 11.66±8.57 16.88±15.43 22.33±15.78

表6 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩频率变化率的影响(±s)

表6 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩频率变化率的影响(±s)

组别 N 给药前 Δt（%）（次/10 min） 低剂量 中剂量 高剂量DMSO 10 7.25±1.83 4.10±16.63 6.19±17.08 7.74±17.78 YMC-6 10 7.00±2.51 8.452±15.58 11.79±13.40 17.74±19.58 YMC-4 10 8.00±2.20 20.98±15.77 25.70±22.02 32.06±26.08

表7 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩活力变化率的影响(±s)

表7 YMC-4、YMC-6对正常大鼠离体子宫收缩活力变化率的影响(±s)

组别 N 给药前 Δt（%）（g×s） 低剂量 中剂量 高剂量DMSO 10 8.95±3.44 6.88±17.72 11.04±19.04 22.51±13.35 YMC-6 10 12.85±9.24 16.12±17.87 22.25±15.93 31.22±22.36 YMC-4 10 13.12±6.70 29.38±18.71 37.30±23.88 47.58±23.04

由表8～表12可见，给予缩宫素后，大鼠子宫收缩明显增强，收缩幅度（最大值、最小值、平均值）、频率和活动力的兴奋率均增大；溶剂DMSO在实验浓度下对子宫收缩频率呈抑制作用，对收缩幅度和活动力呈兴奋作用；与DMSO比较，YMC-4明显抑制缩宫素所致子宫收缩幅度最大值（P＜0.05），而YMC-6对收缩幅度平均值、频率和活动力的兴奋率显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表8 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛大鼠离体子宫收缩最大值变化率的影响(±s)

表8 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛大鼠离体子宫收缩最大值变化率的影响(±s)

注：与DMSO组比较，**P＜0.01

组别 N 剂量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 给药后DMSO 8 — 3.03±0.43 7.78±4.31 9.45±10.31 YMC-6 10 4.00×10-7 6.15±0.88 5.62±2.95 3.12±11.18 YMC-4 8 4.00×10-7 5.27±1.14 5.83±2.91 -6.41±12.86**

表9 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩最小值变化率的影响（±s）

表9 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩最小值变化率的影响（±s）

DMSO 8 — 0.79±0.25 9.61±6.98 10.47±31.56 YMC-6 10 4.00×10-7 0.58±0.16 8.06±6.65 37.78±31.24

YMC-4 8 4.00×10-7 0.58±0.13 9.86±8.11 15.11±20.92

表10 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩平均值变化率的影响(±s)

表10 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩平均值变化率的影响(±s)

注：与DMSO组比较，*P＜0.05

组别 N 剂量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 给药后DMSO 8 — 1.87±0.54 14.83±7.72 17.72±24.27 YMC-6 10 4.00×10-7 1.73±0.36 14.36±7.92 49.38±28.71*YMC-4 8 4.00×10-7 1.69±0.40 15.42±7.86 20.61±32.94

表11 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩频率变化率的影响(±s)

表11 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩频率变化率的影响(±s)

注：与DMSO组比较，*P＜0.05。

组别 N 剂量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 给药后DMSO 8 — 11.00±2.45 1.92±5.44 -0.16±28.72 YMC-6 10 4.00×10-7 5.90±1.66 1.82±10.79 37.71±19.41*YMC-4 8 4.00×10-7 6.90±1.52 6.44±6.91 16.54±24.67

表12 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩活力变化率的影响(±s)

表12 YMC-4、YMC-6对缩宫素致痉挛正常大鼠离体子宫收缩活力变化率的影响(±s)

注：与DMSO组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 N 剂量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 给药后DMSO 9 — 20.56±7.60 2.51±19.28 20.69±59.68 YMC-6 10 4.00×10-7 10.50±4.70 16.44±14.28 109.42±63.02**YMC-4 8 4.00×10-7 11.94±4.90 19.19±11.51* 46.28±69.93

4 讨论与结论

益母草是传统妇科调经中药，以之为原料的益母草注射液则是与缩宫素联用用以缩宫止血的中成药[5]。现代药理研究显示益母草对子宫活动有双向调节作用，其中水部位和正丁醇部位是主要物质基础[6]，而明确报道有此作用的单体化合物主要是属生物碱类的益母草碱和水苏碱盐[7～9]。益母草抗血小板聚集作用的研究早在1982年已有报道，其对烫伤、冰水应激和静脉滴注ADP所致体内血小板聚集异常均有抑制作用[10]。课题组前期研究也发现，益母草注射液对凝血系统具有双向调节作用，其中水溶性非生物碱部分是主要的活血部位[3]，表明益母草调经活血的物质基础不限于生物碱类。

本实验结果显示，YMC-6可抑制ADP诱导的血小板聚焦和延长体外凝血时间，提示其具有抗血小板聚焦和抗凝血作用，可能是益母草活血化瘀的物质基础之一。大鼠子宫试验中， YMC-4、YMC-6对正常离体子宫呈抑制作用趋势，而YMC-6对缩宫素所致大鼠离体子宫痉挛可进一步提高其收缩的平均值、频率和活动力，表现为与缩宫素的协同兴奋作用，YMC-4则抑制缩宫素所致子宫收缩幅度最大值。以上结果表明，益母草倍半萜化合物(2S,5S)-2-hydroxy-2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-en-8-one是益母草活血、调经的物质基础之一，提示益母草中存在多类化学成分以共同发挥其药理作用，在其相关产品质量标准建立时必须考虑指标的选择性。

参考文献

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