穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1诱发小鼠感染模型的体内保护作用研究

何巧，陈思敏，王志华，何敏，谌立巍

穿心莲内酯为中药穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees重要的药效成分之一。现代药理学研究发现穿心莲内酯具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、保肝利胆、治疗心脑血管疾病等多种作用[1～2]。其中有研究显示穿心莲内酯抗菌作用范围广泛，对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等具有较强的抑菌作用，在临床上具有良好的疗效，并可有效降低铜绿假单胞菌毒力因子如绿脓菌素、胞外蛋白水解酶、弹性蛋白酶活性从而实现抗感染作用[3～4]。本课题组在前期的中药抗菌有效成分研究的过程中，发现穿心莲内酯可通过影响铜绿假单胞菌群体感应系统（QS），降低该菌的耐药性发挥抗菌作用[5]。因此，本实验拟采用小鼠腹腔感染铜绿假单胞菌PAO1，考察穿心莲内酯配比左氧氟沙星的体内抗感染作用，为将该药物开发成抗菌药物增效剂提供实验依据。

1 材料

1.1 菌种

铜绿假单胞菌PAO1野生株（Pseudomonasaeruginosa O1，PAO1）由中国科学院上海药物研究所赠送。原始菌种保存于-20℃冰箱（甘油保存）；试验前菌种于M-H(A)平板复活后，选取长势良好的单一菌团涂抹于M-H(A)斜面，35℃隔夜孵育后密封，4℃冷藏保存备用；试验前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育过夜，即可使用。

1.2 试药

穿心莲内酯（四川禾嘉华福宁制药有限公司，生产批号：cxltqw20110528），经高效液相色谱（HPLC）鉴定，纯度高于99%；左氧氟沙星（上虞京新药业，生产批号：DK20-1202093），经经销厂家HPLC测定后，纯度达97.4%，符合实验要求；M-H(A)和M-H(B)培养基（OXOID公司，CM0337A和CM0405B）；其他耗材均由成都雅荣生化设备经营部购买提供。

1.3 仪器

全波长多功能读数仪（Thermo 公司）；MILLIPORE Synergy超纯水仪（Milipore公司）；超净工作台（上海跃进医疗器械厂）；精密恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；低温冷冻离心机Sorvall ST 16R（Thermo Fisher）。

1.4 动物

SPF级KM种小白鼠，18-22 g，雌雄各半，四川省医学科学院实验动物中心提供（生产合格证号：川实动质管第005号；实验动物使用合格证号：川实动质管第022号）。

2 方法与结果

2.1 穿心莲内酯的协同抗感染作用

2.1.1 复制小鼠PAO1腹腔感染模型 将保存于斜面的铜绿假单胞菌PAO1 35℃隔夜孵育复活，挑3～4个单菌落溶于4 mL M-H(B)培养基中调节菌浓度为0.5麦氏（1.5×108CFU．mL-1）浓度，并稀释定容至40 mL；用无菌吸管反复吹打使细菌均匀混悬后将菌液隔夜增菌培养16 h（35℃，空气摇床振摇16 h），次日取出原菌液测OD值（细菌生长饱和期）。取20 mL,分装于离心管中，每管2 mL，离心（10000～15000 rpm．min-1，10 min），弃上清液，用2 mL生理盐水混匀后，再离心（15000 rpm．min-1，10 min），弃上清液；再在离心管中加入生理盐水2 mL，用吸管充分混匀后收集细菌细胞菌体2 mL，设定该菌液为100菌液浓度，用0.5%的灭菌胃膜素（mucin）进行稀释，稀释至10-1，10-2，10-3，10-4备用。取体重18～22 g的小鼠，随机分组，每组8只，分别ip 注射上述菌液至小鼠体内，0.5 mL/只。观察记录各组小鼠24 h死亡情况，以致小鼠90%～100%死亡的最低感染菌量做为最小致死菌量（MLD）。结果显示10-2为最佳剂量，以该菌量做为体内感染的菌量复制小鼠感染模型。

2.1.2 摸出给药的合适剂量范围 得出铜绿假单胞菌MLD后，以左氧氟沙星的临床指定剂量计算小鼠给药剂量，并以该剂量为最高剂量，再10倍稀释左氧氟沙星共获得6个剂量，再分别灌胃给予小鼠不同剂量的左氧氟沙星，摸出致感染细菌的小鼠出现0%～100%存活（或者死亡）的给药剂量范围。选择小鼠存活率为40%～50%时左氧氟沙星剂量。结果显示左氧氟沙星的最佳剂量为0.2 mg．kg-1。

2.1.3 穿心莲内酯和左氧氟沙星配比剂量范围 以2.1.2实验结果为依据，将左氧氟沙星的剂量固定为0.2 mg．kg-1，选择4个较佳配合穿心莲内酯的组合为受试药物.具体见表1。

表1 穿心莲内酯配比左氧氟沙星剂量

2.1.4 体内保护性实验 取健康KM小鼠，体重18～22 g，随机分组，每组50只鼠，雌雄各半，分别腹腔感染1 MLD菌量的受试菌液，0.5 mL/只，感染后即刻灌胃给予不同受试药物，仅给一次，给药后观察并记录各给药组小鼠的死亡数（或存活数），连续观察3天（72 h）。同时设感染对照组及空白对照组。

2.1.5 统计处理 根据各组小鼠死亡数（或存活数）用SPSS统计软件17.0，采用X2方法统计分析数据。

2.1.6 实验结果 具体见表2。实验的结果总体显示左氧氟沙星配比一定剂量穿心莲内酯，有提高左氧氟沙星体内抗感染保护作用的趋势，且在配合穿心莲内酯0.28×10-3时，药物的体内保护作用要优于单独使用左氧氟沙星（p＜0.05），提示穿心莲内酯可增强铜绿假单胞菌对左氧氟沙星的敏感性。

表2 穿行连内酯配比左氧氟沙星对PAO1腹腔感染模型的体内保护作用

2.2 穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1 24 h生长速率的影响

2.2.1 样品配制 称取穿心莲内酯300 mg，加入3 mL二甲基亚砜（DMSO）配成100 mg．mL-1的穿心莲内酯DMSO溶液。吸取1 mL 100 mg．mL-1的药液加入9 mL DMSO得10 mg．mL-1的药液，依次配制1、0.1、0.01、0.001 mg．mL-1的药液。将4℃冷藏保存的PAO1转染至M-H(A)平板上隔夜培养。将长势良好的1～2个传代菌落用生理盐水调至菌液浓度为0.5麦氏浓度。精密量取10 μL药液与9.98 mL M-H（B）培养基均匀混合，装于消毒试管中，再精密吸取10 μL菌液，涡旋仪充分混匀受试样本。分别吸取200 μL加入96孔板中，每组8个复孔，同时设仅加入相同剂量DMSO空白对照组（组7）和仅加入培养基的空白对照组（组8）。具体见表3。

表3 试管基质中菌量和各组药物含量

2.2.2样品检测 将加有样本的96孔板在35℃培养箱中孵育，每隔1h，取样品在420 nm全波长多功能酶标仪下测OD值。将空白组各孔OD值取平均值，设为OD0。

2.2.3 数据处理 记录各组数据，每组取平均值，各组OD值减去OD0作为该组OD值。并作图表示。

2.2.4 实验结果 结果显示，穿心莲内酯各组生长曲线与DMSO空白组之间无差异具体见图1。提示穿心莲内酯不影响PAO1的生长，且DMSO对PAO1无影响。

图1 穿心莲内酯对铜绿假单胞菌24h内生长的影响

3 讨论

抗生素长期应用导致临床有效率不断降低，而且药物的大量使用还可诱导细菌的高度耐药和多重耐药的产生，所以临床相关感染的治疗变得非常棘手。长期的临床实践证实中药在细菌感染性疾病治疗方面具有明确的疗效，穿心莲是清热解毒中药中的代表之一，长期用于细菌感染的治疗，疗效确切。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是临床上获得性感染的重要条件致病菌，常引起呼吸道感染、菌血症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等多种疾病[6]。近年来，由于大量强效抗菌药物的广泛使用，使该菌种呈现出天然或获得性多重耐药,造成难以治愈的严重感染[7]。本实验通过建立铜绿假单胞菌PAO1小鼠腹腔感染模型，以动物死亡率为指标考察药物的体内保护作用。结果显示在一定的配比剂量下，加入了穿心莲内酯的左氧氟沙星普遍表现出保护性作用增强；但是通过测定24 h细菌生长曲线，显示穿心莲内酯没有直接影响细菌生长的作用。综合实验结果和目前穿心莲内酯的抗菌作用研究进展，提示穿心莲内酯在体内可能还通过其它途径发挥抗菌协同作用。

[1] 杨静.穿心莲内酯的研究进展[J].中草药,2009,40(7):1168.

[2] 史传英,董六一.亚硫酸氢钠穿心莲内酯的抗炎解热镇痛作用研究[J].中国民族民间医药,2009,18(12):5.

[3] 李洪涛,吴春民,覃慧敏,等.穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1株MexAB-OprM外排泵mRNA表达的影响[J].中华传染病杂志,2007,25(6):338.

[4] 李洪涛,覃慧敏,王卫华,等.穿心莲内酯对铜绿假单胞菌QS毒力因子的影响[J].中国中药杂志,2006,31(12):1015.

[5] 陈思敏,谌立巍,何敏,等.穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的及对lasR/rhlR表达的调控机制[J].中药与临床2014,30(2):24.

[6] Lisa S,Jane S.Infection control in cystic fibrosia[J].Clin Microbiol Rev.2004,17(1):57.

[7] Nathan EH,Hongwei Y.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of Pseudomonas areuginosa:biofilm formation,virulence,and genome diversity[J].Infect Immun,2004,72(1):133.