不同剂量氯沙坦对氧化修饰型低密度脂蛋白诱导的人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白mRNA表达的影响

武永新 卫政 贺彧彬 柳丽娜 申晓彧

.基础研究.

不同剂量氯沙坦对氧化修饰型低密度脂蛋白诱导的人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白mRNA表达的影响

武永新 卫政 贺彧彬 柳丽娜 申晓彧

目的 探讨不同剂量氯沙坦对氧化修饰型低密度脂蛋白（ox-LDL)诱导的人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA 表达的影响。方法 采用体外密度梯度离心法分离健康人血单核细胞并培养至3～4代，以佛波酯诱导转化为巨噬细胞，用ox-LDL干预细胞使其转化为泡沫细胞，分别用不同剂量氯沙坦（10、50、75和100 μmol/L)干预泡沫细胞，实时PCR检测各组肝X受体、小凹蛋白-1 mRNA的表达情况。结果 与空白对照组比较，ox-LDL组肝X受体mRNA表达（0.26±0.02比1.00±0.02)、小凹蛋白-1 mRNA表达（0.27±0.01比1.00±0.04)均下调，差异有统计学意义（均为P＜0.05)；与ox-LDL组比较，随着氯沙坦剂量的升高，各氯沙坦组的肝X受体、小凹蛋白-1 mRNA表达逐渐上调，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均为P＜0.05)；不同剂量氯沙坦组之间进行两两比较，肝X受体、小凹蛋白-1 mRNA的表达差异均有统计学意义（均为P＜0.05)。结论 氯沙坦可以逆转ox-LDL对人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达的抑制，且呈一定的剂量依赖趋势。

氯沙坦； 氧化低密度脂蛋白； 肝X受体； 小凹蛋白-1； 胆固醇逆转运

泡沫细胞在动脉硬化过程中起关键作用，其形成的主要机制为大量的胆固醇在巨噬细胞内蓄积［1］。胆固醇的外流可使巨噬细胞内胆固醇减少，从而减缓巨噬细胞向泡沫细胞转变。而小凹是细胞胆固醇流出的主要部位［2］。研究表明，肝X受体作为机体保持胆固醇相对稳定的关键感受器和调节因子，可调控胆固醇逆转运［3］。

血管紧张素Ⅱ具有抑制小凹蛋白-1表达的作用［4］，氯沙坦作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂中的一种，其价格低廉、依从性好，并可能通过减少巨噬细胞、抑制平滑肌细胞的移行发挥抗动脉粥样硬化作用［5］，但其是否具有影响胆固醇转运的作用尚不明确。本研究拟观察不同剂量氯沙坦对氧化修饰型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导的人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达的影响，旨在探讨氯沙坦是否具有影响胆固醇逆转运的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20名健康成人静脉血于2013年6月采集自山西医科大学第二医院体检中心；RPMI-1640培养液、胎牛血清购自杭州四季青公司；油红O染液购自武汉博士德生物公司，人淋巴细胞分离液由上海华精生物高科技有限公司出售；佛波酯、多聚肌苷酸均购自美国Sigma公司；TRIzol购自天根生化科技有限公司；FITC-CD14抗体购自日本Beckman Coulter公司；超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、Ul-traSYBR Mixture（with Rox)、Dnasel均购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物序列购自上海生工生物有限公司；ox-LDL购自北京协生生物科技有限公司；氯沙坦为杭州默沙东公司馈赠（批号:C006769)。

1.2 研究方法

1.2.1 人单核细胞的分离 取健康成人新鲜静脉血30 ml，普通肝素抗凝后分至10个试管中。经离心洗涤等后，加含10%胎牛血清的RPMI-1640 5 ml于各试管中，将单核细胞吹开混匀，于各培养瓶中分别加入细胞悬液，置于37℃、5%的CO2培养箱中孵育，培养4代后，取指数生长期细胞进行诱导转化实验。

1.2.2 人单核细胞来源的巨噬细胞的诱导转化、培养与鉴定 将160 nmol/m l的佛波脂、含胎牛血清的RPMI-1640培养液加至单核细胞培养基中培养48 h后，单核细胞转变成巨噬细胞，且巨噬细胞由悬浮生长变为贴壁生长，伸出伪足。使用台盼蓝染色测细胞存活率＞90%。用特异荧光素标记的CD14细胞表面抗体行流式细胞仪鉴定巨噬细胞。

1.2.3 实验分组 实验共分6组:空白对照组（不进行任何干预，仅单独培养单核巨噬细胞48 h)；ox-LDL组（加入ox-LDL 50 μg/ml共同孵育48 h)；氯沙坦4个剂量组（分别加入ox-LDL 50 μg/ml孵育2 h后，再分别加入氯沙坦10、50、75、100 μmol/L共同孵育48 h)。

1.2.4 用实时PCR检测各组中肝X受体mRNA和小凹蛋白mRNA表达的水平 RNA提取:取TRIzol 0.1 ml分别加至每孔，经沉淀、洗涤后，溶解于去核糖核酸酶水（RNase-free Water)30 μl中，应用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA（取5 μl RNA)。

反转录反应:采用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒且在20 μl体系中进行。含引物2 μl、RNA模板2 μl、5×逆转录混合反应体系混合物4 μl，HiFi-MMLV酶复合物1 μl、去核糖核酸酶水11 μl，于PCR仪42℃反应1 h，70℃灭活10 min，最后得到cDNA在-20℃保存。

PCR扩增反应:肝X受体上游引物序列为:5'-TCGCAAGTGCCAGGAGAGTGTC-3'；下游引物序列为:5'-TCCTCCTCTTGCCGCTTCAG-3'；小凹蛋白-1上游引物序列:5'-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3'；下游引物序列为:5'-ACAGACGGTGTGGAACGT AGAT-3'。PCR反应条件:95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃再延伸60 s，然后循环40次。β-actin上游引物序列为:5'-CCTGAGGCA CTCTYCCAG-3'；下游引物序列为:5'-TCACACTTC ATGATGGA-3'，产物大小为100 bp。

荧光定量PCR结果分析:通过完成实时荧光定量PCR反应得到Ct值。mRNA表达相对量用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=（Ct靶基因-Ct内参)处理组-（Ct靶基因-Ct内参)未处理组。空白对照组设为未处理组。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，主要统计指标均进行正态性检验，计量资料用±s表示，多个样本间比较采用Oneway ANOVA检验，主要实验数据来自3次以上重复实验，a=0.05为检验水准。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单核源性巨噬细胞的诱导和鉴定

人静脉血单核细胞经分离培养至第3代，显微镜下观察呈类圆形悬浮细胞。加入佛波酯诱导其转化为巨噬细胞培养48 h，镜下可见细胞贴壁并伸出伪足，呈不规则形状。经流式细胞术鉴定90%以上单核细胞成功转化为巨噬细胞，见图1。

图1 佛波酯诱导后的人巨噬细胞（箭头所示，×400)

2.2 泡沫细胞模型建立与鉴定

在各组诱导成功的巨噬细胞培养液中加入ox-LDL，培养48 h，显微镜下观察可见细胞较前饱满，形态发生改变，呈条索状荷脂状态。以油红O染色后观察荷脂细胞胞质被染成橘红色，见图2。

图2 泡沫细胞模型建立与鉴定（×400)

2.3 ox-LDL诱导的单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA的表达

与空白对照组比较，其他各组肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达均下降，差异有统计学意义（均为P＜0.001)；与ox-LDL组比较，随着氯沙坦浓度的升高，不同剂量氯沙坦组肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达明显增加，且呈剂量依赖趋势（P＜0.05)，见表1。

表1 各组肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达水平（±s)

表1 各组肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达水平（±s)

注:与空白对照组比较，aP＜0.05；与ox-LDL组比较，bP＜0.05；与氯沙坦10 μmol/L组比较，cP＜0.05；与氯沙坦50 μmol/L组比较，dP＜0.05；与氯沙坦75 μmol/L组比较，eP＜0.05

组别样本量肝X受体mRNA小凹蛋白-1 mRNA空白对照组3 1.00±0.02 1.00±0.04 ox-LDL组3 0.26±0.02a0.27±0.01a氯沙坦10 μmol/L组3 0.40±0.03ab0.36±0.04ab氯沙坦50 μmol/L组3 0.56±0.02abc0.47±0.04abc氯沙坦75 μmol/L组3 0.65±0.02abcd0.55±0.03abcd氯沙坦100 μmol/L组3 0.79±0.07abcde0.64±0.04abcdeF值193.813 159.163 P值＜0.001＜0.001

3 讨论

细胞内游离胆固醇经细胞膜的特定区域流出到细胞外称之为胆固醇流出，此过程在维持细胞内胆固醇动态平衡中发挥重要的作用［6］。泡沫细胞由巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质尤其是ox-LDL而形成，此过程本身为保护机制，关键在于吞噬脂质后能否将其代谢并转运出去［7］，过多的胆固醇在细胞内蓄积可使巨噬细胞变成泡沫细胞［1］，进一步促进动脉硬化的发生。胆固醇的外流，可使泡沫细胞内胆固醇的含量下降［8］，胆固醇逆转运是机体排除过多胆固醇的唯一途径，在维持生物体胆固醇代谢稳态方面有重要作用［9］。

小凹是细胞胆固醇流出的主要部位［2］，可通过与多种信号分子结合从而调控细胞的跨膜信号转导，参与细胞生命活动［10］。小凹蛋白-1是小凹的主要组成蛋白，可通过对胆固醇外流调节信号转导，促进细胞内游离胆固醇的流出，实现胆固醇逆向转运［11］。有研究显示，血管紧张素Ⅱ具有抑制小凹蛋白-1表达的作用［4］，氯沙坦作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，应具有阻断此途径作用，从而上调小凹蛋白的表达，进一步影响胆固醇的转运。本实验结果显示，与空白对照组比较，ox-LDL组及氯沙坦组小凹蛋白-1 mRNA的表达均明显下调，提示经ox-LDL诱导的人单核巨噬细胞可使小凹蛋白-1 mRNA的表达下调，不同剂量氯沙坦组较ox-LDL组小凹蛋白-1 mRNA的表达均明显上调，并在一定程度上呈剂量依赖关系，进一步印证了氯沙坦具有阻断血管紧张素Ⅱ抑制小凹蛋白-1表达的作用。小凹蛋白在胆固醇的转运及流出中发挥重要的作用，因此氯沙坦可能通过对小凹蛋白-1表达的影响进一步在胆固醇的转运及流出中发挥作用。

肝X受体作为调节胆固醇代谢的最重要核转录因子，在维持机体胆固醇的动态平衡中起重要作用［12］。激活的肝X受体可通过上调ABCA1、ABCG1和apoE的表达，转运细胞内的胆固醇及磷脂到细胞外受体，参与胆固醇流出，从而防止大量的胆固醇在细胞内蓄积［13-14］，Naik等［15］通过体内同位素氚标记的巨噬细胞胆固醇示踪，证实了肝X受体激动剂可加速巨噬细胞源性的胆固醇逆转运。由此可见，肝X受体在胆固醇代谢中起重要作用。

本实验结果还显示，与空白对照组比较，ox-LDL组及氯沙坦组肝X受体mRNA的表达均明显下调，提示经ox-LDL诱导的人单核巨噬细胞可使肝X受体mRNA的表达下调，不同剂量氯沙坦组较ox-LDL组肝X受体mRNA的表达均明显上调，并在一定程度上呈剂量依赖关系，进一步可能促进胆固醇的流出，防止大量胆固醇在细胞内蓄积，其机制可能为氯沙坦上调LXR的表达进而影响ABCA1、ABCG1和apoE的表达。

综上所述，氯沙坦可逆转ox-LDL对人单核巨噬细胞肝X受体及小凹蛋白-1 mRNA表达的抑制，进而可能影响胆固醇逆转运，促进斑块消退，从而拓宽了氯沙坦在临床上的应用，但具体通过何种途径发挥此作用，有待进一步研究。

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Effects and mechanism of different doses of losartan on expressions of liver Xreceptor and caveolin-1 in cultured human monocyte-macrophage cells induced by oxidized low density lipoprotein

Wu Yongxin，Wei Zheng，He Yubin，Liu Lina，Shen Xiaoyu.
Department of Cardiology，the Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the influence of different doses of losartan on the expression of liver X receptor（LXR)and caveolin-1 in cultured human monocyte-macrophage cells which were induced by oxidized low density lipoprotein（ox-LDL).M ethods The mononuclear cells of healthy people were separated by using in vitro density centrifugation method and cultured to the 4th generation.Macrophages were induced by phorbol ester（160 nmol/ml)after 24 h culture.The human monocyte-macrophage cells were divided into six groups:control group，ox-LDL group，different doses of losartan group（10，50，75 and 100 μmol/L).The expressions of LXR mRNA and caveolin-1 mRNA were detected by RT-PCR. Results Effects of different doses of losartan on expressions of LXR mRNA and caveolin-1 mRNA in cultured human monocyte-macrophage cells induced by ox-LDL:comparison among six groups，the differences were statistically significant（F=193.813，159.163，both P＜0.001).Compared with control group，the expressions of LXR mRNA（0.26±0.02 vs.1.00±0.02)and caveolin-1 mRNA（0.27±0.01 vs.1.00± 0.04)were significantly decreased in the ox-LDL group，and they were in a concentration-dependent manner（all P＜0.05).Compared with ox-LDL group，the expressions of LXR mRNA and caveolin-1 mRNA were significantly increased in different doses of losartan groups in dose-dependent manner（all P＜0.05). Different doses of losartan were compared between groups（between each group P＜0.05)，the difference between each two groups was statistically significant（P＜0.05).Conclusions Losartan can reverse the inhibition of the expressions of LXR and caveolin-1 mRNA in cultured human monocyte-macrophage cells induced by ox-LDL in a dose dependent manner.

Losartan； Oxidized low density lipoprotein； Liver X receptor； Caveolin-1；Reverse cholesterol transport

Shen Xiaoyu，Email:shenxy65@sina.com

2014-04-10)

（本文编辑:谭潇)

This work was supported by a grant from the Science and Technology Research Projects of Shanxi Province（NO.20120313020-10).

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.05.012

山西省科技攻关项目（20120313020-10)

030001太原，山西医科大学第二临床医院心血管内科

申晓彧，电子信箱:shenxy65@sina.com