Toll样受体4与2型糖尿病微血管并发症关系的新进展

秦宁宁(综述)，王秋月(审校)

(中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳 110001)

糖尿病的发病率逐年升高，成为当今社会多发病、慢性病之一，其并发症严重困扰着人们的生活。作为模式识别受体之一的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)具有激活抗原呈递细胞的潜在免疫调节能力，可诱导产生大量炎性因子并激活炎性反应细胞到达病灶而杀死病原体[1]。其中，TLR4在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)及其并发症，特别是微血管并发症中起着至关重要的作用。

1 TLR4的化学结构及生物学功能

1.1TLR4结构及分布 1997年Medzhitov等[2]首次发现与果蝇Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其编码的TLR蛋白，即如今的TLR4蛋白。其基因位于第9号染色体，是人类发现的第一个Toll相关蛋白，属于Ⅰ型跨膜受体。TLR胞外区由18～31个富含亮氨酸的重复序列组成，其中TLR4具有24个亮氨酸重复序列；胞内区含有大约200个氨基酸残基，由Toll同源结构域和分子C端长短不同的短尾肽(0～22个氨基酸)组成[3]。TLR4分布于许多免疫和非免疫细胞，如外周血白细胞、巨噬细胞、B/T淋巴细胞、角膜上皮细胞、微血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及单核细胞等。

TLRs家族成员种类繁多，已发现的TLRs蛋白包括人类的11种及鼠类的13种。研究发现，TLRs家族在体内慢性炎性反应中起着重要作用[4]。TLRs主要在参与免疫反应的组织和细胞中表达，其分布也提示TLRs是天然免疫系统中重要的模式识别受体。TLR4是研究最早、作用最为明确的TLR分子，能识别多种配体，如脂多糖、热激蛋白70、热激蛋白60及高速泳动族B1蛋白(high-mobility group box protein-1，HMGB1)等，识别的病原菌主要是革兰阴性菌、厌氧菌、致密螺旋体。促炎细胞因子的合成与释放是TLRs分子最突出的生物学活性。TLR4配体通过与其受体结合，经信号转导途径激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，分泌释放白细胞介素(interleukin，IL)1、IL-6、IL-12、IL-8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干扰素γ等细胞因子，这些细胞因子可促进杀菌及吞噬活性，同时也在炎性反应中起重要作用[5-6]。

1.2TLR4的信号转导途径 TLR4为TLRs家族最受关注的成员之一，可介导多种信号通路诱导炎性因子的释放及体内炎性反应的发生。但是其介导的信号通路复杂且存在很多争议，目前研究表明，TLR4的信号转导途径主要有两条：髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)依赖性及非依赖性途径[7]。

MyD88是TLR4信号转导途径的主要接头蛋白，相对分子质量为3.5×104，含有三个功能域，包括N端的死亡域、中间的连接域和C端的Toll/IL-1受体域。利用MyD88基因剔除小鼠研究TLR4的两种信号转导途径发现，MyD88对早期脂多糖反应具有重要作用[8]。革兰阴性菌释放的脂多糖在血流中与血清因子脂多糖结合蛋白形成复合物，然后与单核细胞、巨噬细胞表面的膜性CD14相互作用。内皮细胞与成纤维细胞缺乏CD14，但是可以利用可溶性的CD14促进与脂多糖的结合，脂多糖、脂多糖结合蛋白和CD14三者相互作用激活TLR4信号途径。MyD88依赖途径包含许多信号分子：接头蛋白MyD88、IL-1受体相关激酶、转化生长因子β-活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase-1，TAK1)、转化生长因子β-活化激酶结合蛋白(transforming growth factor-β-activated kinase binding protein，TAB)1、TAB2和TNF受体相关因子6。IL-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)是IL-1受体和TLR丝氨酸/苏氨酸激酶，激活NF-κB，有四个IRAK参与TLR信号，分别为IRAK1，IRAK2，IRAK4和IRAK-M。TLR一旦被病原相关分子模式刺激，MyD88作为接连蛋白就被招募到TLR，与其Toll/IL-1受体结构域结合；MyD88进一步招募IRAK4形成TLR-MyD88-IRAK4信号复合物，然后再招募IRAK1，接着磷酸化使其激活；激活的IRAK1，其N端残基发生自身磷酸化，从而导致TNF受体相关因子6的招募，并结合到信号复合物的受体上；然后，IRAK1-TNF受体相关因子6复合物从受体分离，与另一种由TAK1、TAB1和TAB2组成的复合物相互作用，TAK1发生磷酸化并被激活，使核因子κB抑制蛋白激酶磷酸化，导致NF-κB激活，诱导产生IL-1、IL-6、IL-8和TNF等促炎性细胞因子，促进和放大吞噬细胞的杀菌作用[9]。

MyD88非依赖性的信号途径又称干扰素βToll/IL-1受体结构域衔接蛋白依赖途径[10]，β干扰素Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白与TNF受体相关因子家族成员相关的NF-κB激活剂结合激酶1、核因子κB抑制蛋白激酶以及干扰素调节因子3结合，使核因子κB抑制蛋白激酶发生磷酸化并激活干扰素调节因子3，从而使其相应的因子转录，主要触发诱导干扰素β[11]。

2 TLR4在T2DM中的表达

随着人们生活方式及饮食习惯的改变，近年来糖尿病的发病率持续升高。糖尿病是一种炎症状态，表现为循环及细胞生物标志物的增加，如血浆C-反应蛋白、细胞因子(IL-1、TNF、IL-6)、趋化因子和纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1[12]。有研究表明，在糖尿病患者的外周血单核细胞中存在TLR4的表达升高，且与炎性反应相关[13]，T2DM患者存在代谢紊乱、氧化应激增强等，可使TLR4内源性配体非脂化脂肪酸、氧化型低密度脂蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、热激蛋白70等增多。T2DM患者肌肉和单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达增加，并与血浆炎性反应因子水平呈正相关[14]。TLR4及其配体表达增多，激活TLR4信号通路，参与炎性反应[15]。

T2DM患者本身的细胞功能异常也可以增强TLR4信号通路的作用，高糖可以增加细胞对脂多糖的敏感性。高糖作用的细胞受脂多糖作用后，炎性反应因子、趋化因子及基质金属蛋白酶表达明显增强[16-17]。高糖的刺激作用可使细胞TLR4表达上调，增强氧化应激，NF-κB活化和促炎细胞因子的释放，进而增强TLR4信号通路，参与炎性反应[18]。

3 TLR4与T2DM微血管并发症

微血管一般指微小动脉和微小静脉之间的毛细血管及微血管网。糖尿病微血管病变主要表现在视网膜、肾、神经组织及皮肤等，其中以糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)和视网膜病变最为重要。T2DM患者中性粒细胞受脂多糖作用后较正常人产生更多的炎性反应因子，T2DM鼠巨噬细胞受脂多糖刺激后，炎性反应因子分泌较对照鼠增多，表明T2DM中TLR4信号通路作用增强，TLR4配体与其受体结合，通过MyD88依赖性和非依赖性信号转导途径，诱导炎性反应因子和干扰素的表达，参与对炎性反应性疾病的发生[19]。TLR4介导的免疫反应的大小和持续时间，由TLR4配体的有效性、TLR4的数量及TLR4负向调节信号蛋白所决定。外源性及内源性配体可增加TLR4的表达，进而增强TLR4介导的免疫反应。有研究表明，TLR4依赖反应有助于新生血管的HMGB1在缺血性神经组织的释放，这确认了TLR4对缺血性神经组织的神经胶质细胞的激活，有助于新生血管的形成，表明TLR4在T2DM微血管并发症中起着至关重要的作用[20]。

3.1糖尿病视网膜病变 糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见、最主要的微血管并发症之一，已经成为当前全球致盲的重要原因，其发生与病程相关，糖尿病病程超过10年，大部分患者合并程度不等的视网膜病变。其发病机制认为是由于视网膜微血管系统受损所致。HMGB1是细胞核内除组蛋白外的染色质蛋白，是一种多功能蛋白，参与调控基因表达、促进细胞生长、抑制巨噬细胞生长及诱导其凋亡、促进肿瘤细胞侵袭和血管生成、诱导炎症发生、激发免疫反应等，是TLR4内源性配体之一，由单核细胞/巨噬细胞分泌[21]。HMGB1的信号主要有3个受体，包括高级糖基化终产物受体、TLR2和TLR4[22]。

有研究表明，鼠角膜和培养的人角膜上皮细胞表达TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9，角膜炎症主要依赖于TLR4信号，因为炎症是一个重要过程，链接血管的生成[23]。Park等[24]研究发现，细胞外的HMGB1可以在脂多糖、TNF-α或IL-1的刺激下由单核细胞主动分泌，还可以通过与其受体TLR4结合，诱导产生炎性因子、趋化因子、生长因子和黏附因子，以致诱导视网膜新生血管形成，破坏血-视网膜屏障。

3.2DN DN是糖尿病常见的微血管并发症之一，常见于病史超过5年的患者，临床特征为蛋白尿，渐进性肾功能损害、高血压、水肿，晚期出现严重肾衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前认为DN受多方面因素影响，包括遗传因素、血流动力学异常以及高糖相关的生化代谢异常等[25-26]。在DN患者肾组织中发现TLR4表达明显上调，并与蛋白尿、肾功能状态密切相关，这对理解DN的发病机制并早期干预DN的进展有重要的理论意义及使用价值。

目前认为，肾小球损伤是引起DN发生、发展的最主要因素，Kaur等[27]运用在体外培养的小鼠肾小球系膜细胞，与暴露于5.5 mmol/L葡萄糖24 h相比，暴露于25 mmol/L葡萄糖24 h可导致TLR4 mRNA和细胞表面受体的表达有所增加；并且还发现MyD88、干扰素调节因子3、β干扰素Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白相关的接头分子、NF-κB的活化炎性细胞因子IL-6和单核细胞趋化蛋白1、转化生长因子β的水平在25 mmol/L葡萄糖的存在下均显著增加。Festa等[28]研究表明，DN患者的血浆中C反应蛋白、TNF-α、IL-6等炎性因子的浓度均显著升高，与24 h尿蛋白排泄量呈正相关，与内生肌酐清除率呈负相关，提示炎性反应与DN的发生、发展有密切的联系。而TLR4是脂多糖受体复合物的重要组成部分，在体内脂多糖能促进免疫细胞和非免疫细胞释放致炎细胞因子和化学因子，从而导致内毒素性休克，此过程受TLR4调节。单核巨噬细胞、树突状细胞等可通过TLR4接收脂多糖的刺激，经由细胞内信号转导通路活化NF-κB，转录合成IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及干扰素γ等细胞因子，并使其释放到细胞外，使毛细血管通透性增加、淋巴细胞浸润等炎性反应，导致肾小球功能损伤[29]。

近年来有研究发现，肾小管损伤在DN的发病机制中也起着重要作用[30]。肾小管损伤与肾小球损伤同时发生在DN早期，肾小管上调TLR4的内源性配体HMGB1，在体外高糖诱导TLR4通过蛋白激酶C激活，上调IL-6和趋化因子，通过核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB配体2的表达激活人近端肾小管上皮细胞，TLR4干扰RNA衰减高糖诱导的核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB的活化，抑制合成IL-6和单核细胞趋化蛋白1，表明TLR4介导的信号通路在DN可促进肾小管间质炎症[31]。

3.3糖尿病周围神经病变 目前超过50%的糖尿病患者都存在神经病变，其主要是由于高血糖诱导的神经细胞毒性和神经血管血流减少导致的缺血性神经细胞损伤。有证据表明，神经性疼痛，神经损伤产生具有中枢神经系统神经免疫组分。在神经损伤后，TLR4释放其配体饱和脂肪酸，与膜结合，相互作用诱导NF-κB激活和环氧化酶2及其他炎性标志物的上调[32]。直接参加TLR4表达的趋化因子、整合和黏附因子都有助于中枢敏感化，称为行为超敏反应。也就是说，TLR4表达是一个小胶质细胞传感器触发胶质细胞激活和中枢神经系统的免疫反应，因此通过激活TLR4信号转导通路，调节神经胶质激活，导致中枢敏感化和神经损伤引起行为超敏反应。还有研究证实，通过链脲佐菌素诱导糖尿病的大鼠表现出强劲的痛觉过敏，可使TLR4 mRNA表达上调，并且激活TLR4信号转导通路，产生炎性因子，表明TLR4是治疗糖尿病周围神经病变的一个新目标[33]。

4 展 望

TLR4信号通路在评估糖尿病并发症过程中起着至关重要的作用，尤其是糖尿病微血管并发症，及早的对其进行干预，能延缓其发生，特别是DN，TLR4的信号转导通路为其早期预防提供了新的靶点。其通过肾小球及肾小管损伤而诱导DN的发生机制，需要大量深入的研究来阐明，为早期诊断糖尿病微血管并发症并予以有效治疗提供新的理论依据。

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