循环肿瘤细胞致肿瘤血行转移研究进展

乔雪峰，张玉娟，崔 巍

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科， 北京 1007302北京煤炭总医院检验科， 北京 100028

·综 述·

循环肿瘤细胞致肿瘤血行转移研究进展

乔雪峰1,2，张玉娟1，崔 巍1

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科， 北京 1007302北京煤炭总医院检验科， 北京 100028

循环肿瘤细胞；血行转移

众所周知，肿瘤转移是造成肿瘤患者死亡的重要原因之一。原发肿瘤释放成千上万的肿瘤细胞入血，但仅有不足0.01%的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)能够在外周血存活并形成转移[1]，CTCs检测在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种癌症中具有诊断、判断预后等价值[2]。以往认为肿瘤转移发生在原发肿瘤形成后，经典的肿瘤转移经过原发灶肿瘤、肿瘤细胞播散入血并在外周血存活、组织侵袭、形成转移灶等阶段[3]；但最近研究发现，上皮细胞播散可发生于癌前病变极早期，在形成明显的原发灶之前，上皮细胞或已脱落入血并在远处定植[4]。肿瘤细胞脱落入血，CTCs在进行血行转移的过程中受到宿主细胞和血液微环境等多方面因素的调控，需要不断获得适应微环境的生存能力，因此认识和探讨CTCs的血行转移调控机制能够为临床监测肿瘤播散转移提供重要价值。

循环肿瘤细胞存活于外周血

研究表明，上皮来源的肿瘤细胞脱离原发灶进入血液循环后，会发生细胞性质改变，一部分上皮性肿瘤细胞转变为具有“漫游”特征的间充质细胞[5]，发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而失去与邻接上皮细胞间的联系，并进一步克服血流剪切力及免疫系统等各种微环境因素的破坏而存活下来。在此阶段，血小板对CTCs起到了重要保护作用[6]。

CTCs入血0～2 min内即可与血小板发生直接或间接的相互作用。首先，CTCs通过高表达组织因子(tissue factor，TF)而激活凝血系统，促使血小板向其聚集[7]；其次，CTCs表面的整合素αvβ3及活化的血小板表面的αIIbβ3均能结合纤维蛋白，三者形成肿瘤细胞-纤维蛋白-血小板聚集体；再次，CTCs可借助P-选择素配体与血小板表面的P-选择素受体相结合，诱导血小板向其聚集[8]。血小板向CTCs聚集能为后者提供物理屏障，从而可有效避免自然杀伤(natural killer，NK)细胞对CTCs的免疫清除，同时还可赋予CTCs宿主MHC I类分子特性，干扰NK细胞丢失自我(missing-self)而杀伤自身；血小板释放的转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)和血小板生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，可分别下调NK细胞NKG2D免疫受体和抑制NK细胞杀伤作用[9]。肿瘤细胞的促凝活性有助于其在循环中播散，肿瘤接种前静脉注射重组鼠源性组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)能抑制83%的CTCs诱导的肿瘤转移[10]；低分子量肝素能抑制P-选择素及其配体结合，削弱血小板-肿瘤细胞间的相互聚集，从而抑制肿瘤转移[11]。研究亦发现，循环肿瘤细胞簇(CTC clusters)及黏附于其他细胞的CTCs，与单个CTCs相比，其存活率及活性均明显增高。但目前CTCs分离计数方法的处理过程，会分散聚集状态下的CTCs，导致CTCs某些生物信息丢失[12]。

血小板除对CTCs具有保护作用外，还具有促进肿瘤转移的潜能。多种肿瘤患者的高血小板计数及血小板凝聚与患者生存期降低具有相关性[6]，血小板α-颗粒储存了大量促血管生成因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor，EGF)、PDGF、胰岛素样生长因子1和2 (insulin-like growth factor- 1/- 2，IGF- 1/- 2)等，促进内皮细胞的活化，并直接募集骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)，促进肿瘤生长[13]，对血小板和肿瘤细胞表面的整合素进行封闭或基因清除能抑制肿瘤转移。

肺转移癌模型研究亦发现，巨噬细胞和骨髓来源的免疫细胞亚群均有促进肿瘤细胞存活和增殖的作用，如CTCs表达血管细胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)与巨噬细胞表达的整合素α4结合，能保护CTCs免受肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing-ligand，TRAIL)的破坏，促进CTCs的存活与转移[14]。

循环肿瘤细胞浸润

CTCs入血后即在中性粒细胞及单核巨噬细胞的帮助下，与血管内皮细胞建立初始联系，以利于后续的转移。目前，关于外周血管捕获肿瘤细胞的假说有两种，其一为物理捕获假说[15]，即肿瘤细胞直径大多为20～30 μm，当脱落入血的CTCs首次经过循环下游内径约8 μm左右的毛细血管床时能被轻易捕获，且CTCs之间及其与宿主细胞间的相互聚集会进一步促进对CTCs的捕获；临床上结直肠癌大多转移至肝脏，乳腺癌常转移至肺，这是由肿瘤所在部位的循环模式所决定的。研究亦发现，CTCs除被毛细血管捕获外，还能被内径较大的血管所捕获，提示CTCs与内皮细胞间初始联系的建立还存在其他机制，即黏附分子介导假说[16]。该假说认为，CTCs通过其表达的黏附分子与血细胞相互作用从而获得向内皮细胞滚动、黏附及随后外侵的能力。这两种假说亦可同时存在，即CTCs入血后短时间内出现的捕获大多是被动的，遵循物理捕获假说；而在宿主非肿瘤细胞协助下，CTCs与血管内皮细胞间形成的特异、持久的黏附则可能遵循后一种假说。研究发现，在最初24 h内，初始捕获于脑部毛细血管的黑色素瘤细胞或肺癌细胞会反复几次进入或离开该捕获位点，此时肿瘤细胞死亡率非常高，能否维持于初始捕获位点并完成随后浸润，取决于肿瘤细胞的自身特性或与其自身相关的血栓、血小板和白细胞等的相互作用[17]。

原发肿瘤分泌的可溶性因子会先于CTCs到达预捕获位点，增强该位点局部的通透性，并可诱导BMDCs向转移靶器官募集，形成转移前微环境(premetastatic niches)，以利于肿瘤细胞的定居和生长[18]。干扰肿瘤细胞对宿主促转移细胞的募集及相互作用，能明显抑制肿瘤转移[8]。原发肿瘤还会触发炎症反应，引起内皮细胞和血小板活化，动员各种类型BMDCs细胞，包括非成熟髓系细胞、中性粒细胞及单核细胞，促进肿瘤转移[18- 19]，髓系细胞释放白细胞介素(interleukin，IL)- 1α、IL- 1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，介导内皮细胞活化，进而表达E-选择素(E-selectin)、P-选择素(P-selectin)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule- 1，ICAM- 1)或VCAM- 1，上述细胞黏附分子与CTCs表面相应配体结合，进而促进CTCs的滚动与黏附。

体外研究亦表明，肿瘤细胞活化内皮细胞的过程是P-选择素依赖且需要血小板、中性粒细胞及肿瘤细胞同时存在，如结直肠癌细胞会联合血小板和中性粒细胞共同活化内皮细胞[20]。黏附于内皮细胞的活化血小板可借助其表面的P-选择素与白细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1相结合，募集白细胞并活化白细胞整合素β2[21]，后者有助于与血小板整合素αIIbβ3结合的纤维蛋白原相结合，稳定血小板-白细胞间的相互作用。白细胞在肿瘤转移的早期阶段起促进作用，血管内捕获位点若不能诱导L-选择素配体的表达，则肿瘤转移会减弱，基因或药物清除单核/巨噬细胞系细胞会减少肿瘤转移[22]。而小鼠模型研究发现，小鼠在注射黑色素瘤细胞后1 h，再经尾静脉注射中性粒细胞，24 h后肺内CTCs明显增加[23]。但亦有研究显示，分离自荷瘤小鼠，分子标记为CD11b+Ly- 6G+MMP- 9+的肿瘤携带中性粒细胞(tumor-entrained neutrophils，TENs)可产生高水平的过氧化氢，杀死肿瘤细胞，对抗乳腺癌细胞在肺中的转移播散[24]。可见，中性粒细胞具有促进及抑制肿瘤转移的双重作用，其趋向取决于其所处的微环境，如聚集于肿瘤细胞周围的血小板可释放TGF-β封锁TENs的活性而促进肿瘤转移[25]。

循环肿瘤细胞转移

肿瘤细胞转移效率依赖于其自身行为和宿主组织特性。肿瘤细胞入血后1～3 d发生转移，CTCs与血小板间的相互作用会加快其转移的速度。血小板源性TGF-β与血小板-CTCs的直接接触会激活CTCs TGF-β/Smad 和NF-κB信号通路[25]，引起肿瘤细胞发生EMT，使得CTCs上皮标志表达基因受抑而间质细胞标志基因表达活跃，由此增强外侵及播散能力；当CTCs到达转移靶器官后，再经过间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)，继续增殖进而形成肿瘤转移灶[26]。参与EMT过程的几种生长因子中TGF-β的研究最为广泛，清除血小板特异性TGF-β会破坏肿瘤细胞外侵，降低肿瘤转移[27]。上述CTCs中NF-κB信号通路激活还能促进促炎症趋化因子2(chemokine C ligend 2，CCL2)的表达，募集单核细胞[19]，参与肿瘤转移。

同时，各种促转移基因的表达能改变机体的微环境，增强血小板活化的肿瘤细胞侵袭能力[25]，如与血管及细胞外基质重塑相关基因(EREG, COX2, MMP1, MMP2)表达上调促进CTCs的外侵和转移[28]，高表达血管生成素样蛋白ANGPTL4和血管内皮生长因子VEGF-A的CTCs更容易形成肺转移[29]。并且转移相关巨噬细胞(标记为F4/80+CD11b+Gr1-)分泌VEGF-A，可增加血管内皮细胞通透性，促进肿瘤细胞外侵、播散及生长[30]。结直肠癌实验性转移模型发现，CTCs来源的CCL2可直接向内皮细胞表达的CCR2传递信号，增加血管通透性，促进CTCs的转移，且完全独立于髓细胞的作用[31]。转移位点成纤维细胞表达的骨膜蛋白periostin和细胞黏合素tenas-cin C是转移成功所必需的[32]，TGF-β与这2种蛋白的表达增强有关，再次提示肿瘤细胞或宿主细胞表达的TGF-β对肿瘤转移启动的重要性。

总之，肿瘤细胞脱落入血并在外周血中存活以及外侵转移受细胞本身和微环境的多重因素影响和调控，包括血小板-CTCs、肿瘤细胞-内皮细胞、单核巨噬细胞-内皮细胞之间的相互调控。以上假说多基于动物实验，而作为现阶段肿瘤血行转移研究的标准模式，动物模型的建立存在些许不足，如此类方法研究肿瘤细胞血行转移的过程缺乏原发肿瘤，CTCs入血方式不是原发肿瘤脱落而是人为的直接静脉注射，CTCs在循环中停留时间相对较短等。因此，对CTCs与肿瘤转移的认识不可避免地存在局限性，结论是否适用于人体肿瘤等尚需更多临床试验性研究验证与解答。随着实验技术的进展，相信在不远的将来，人类终将揭开肿瘤转移过程的神秘面纱，肿瘤亦将不再可怕。

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2014- 04- 29)