大网膜包裹自体心房组织联合移植对慢性心肌梗死大鼠心功能的影响*

侯剑峰，张昌伟，郑哲，胡盛寿

基础与实验研究

大网膜包裹自体心房组织联合移植对慢性心肌梗死大鼠心功能的影响*

侯剑峰，张昌伟，郑哲，胡盛寿

目的：探讨大网膜包裹自体心房组织联合移植对慢性心肌梗死大鼠心脏功能的影响。

心肌梗死；大网膜包裹

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1015.)

组织工程心肌的出现为心肌梗死的治疗提供了新的途径，但由于目前所构建的组织工程心肌厚度和体积以及生物学功能尚显不足，无法短期内实现临床转化[1]。在本研究中我们选择自体心耳组织裁剪后作为心肌补片，通过观察大网膜包裹自体心房组织联合移植对慢性心肌梗死后大鼠心脏功能的影响，探讨该技术的治疗作用并初步分析其可能治疗机制。

1 材料与方法

实验动物与方法：实验时间2011-09至2012-09。实验动物为SPF级Sprague-Dawley大鼠，均由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，6～8周龄，体重260～280 g，雌雄各半。采用冠状动脉结扎法建立心肌梗死模型[2]。3周后，使用超声心动图筛选大鼠心肌梗死模型（左心室短轴缩短率＜30%，左心室射血分数＜60%）将存活大鼠120只随机分为4组，每组30只完成第二次手术：①对照组：仅再次开胸；②心耳组：二次开胸后，裁取左心耳组织移植于心肌梗死及边缘区；③大网膜组：二次开胸后，正中开腹将大网膜经过膈肌包裹至心肌梗死区；④联合移植组：二次开胸后，先行左心耳移植，然后完成大网膜包裹术。

手术方法：慢性心肌梗死模型完成3周后，在助手协助下切除自体心耳组织，修剪成心肌补片，间断缝合至心肌梗死疤痕及边缘区（心耳组，红色区域），后将大网膜经过膈肌包裹至自体心耳补片移植区域（联合移植组），见图1。

图1 大网膜包裹自体心房组织联合移植手术简图

观察指标：手术4周后，Masson染色检测心肌梗死面积和疤痕厚度，免疫组化评价心耳存活、血管新生情况，蛋白免疫印迹法检测血管内皮生长因子（VEGF）、金属蛋白酶（MMP-2/MMP-9）及其抑制物（TIMP-3）蛋白表达，明胶酶谱法评价金属蛋白酶活性；分别以黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定梗死及周边区内心肌组织超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量；超声心动图评价心脏功能。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，计量数据采用表示,α=0.05为显著性检验水准。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1死亡率

本实验共纳入120只大鼠，第二次手术后4周内四组死亡率分别为：对照组6只（27.3%），大网膜组5只（23.8%），心耳组5只（22.7%），联合移植组5只（22.7%），四组死亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2大网膜包裹促进移植左心耳存活

为评价左心耳移植后的存活情况，我们采用免疫组化方法对肌钙蛋白-I进行染色（胞浆黄褐色为阳性染色），移植4周后，心耳组在心肌梗死区域未发现肌钙蛋白-I染色阳性心肌细胞，而在联合移植组心肌梗死区域的外侧可以发现肌钙蛋白-I染色阳性心肌细胞（心外膜外，红色箭头中间区域，如图2），提示在大网膜作用下左心耳部分存活。

图2 存活心耳组织免疫组化检测

2.3心脏功能

第二次手术完成后4周，四组超声心动图左心室功能指标比较结果如表1所示：与对照组相比，联合移植组左心室射血分数和左心室短轴缩短率升高（P均＜0.05），而且左心室舒张末径和左心室收缩末径显著下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 四组超声心动图左心室功能指标比较（n=30 ,

表1 四组超声心动图左心室功能指标比较（n=30 ,

注：与对照组比较*P＜0.05

左心室舒张末径(mm)对照组 47.5±4.5 20.7±2.0 6.6±0.6 8.3±0.6大网膜组 52.7±5.8 23.8±3.4 6.4±0.6 8.4±0.6心耳组 52.5±5.5 23.7±3.2 6.3±0.6 8.3±0.7联合移植组 57.9±5.8* 25.2±3.6* 5.7±0.3 * 7.6±0.4*组别 左心室射血分数(%)左心室短轴缩短率(%)左心室收缩末径(mm)

2.4毛细血管密度

心肌梗死边缘区的血管新生通过毛细血管密度（免疫组化方法CD31染色）评价，阳性表达CD-31分子的新生血管内皮细胞在胞浆中呈黄褐色，结果如图3所示：与对照组血管密度（33/0.2 mm2）相比，大网膜组（49/0.2 mm2）以及联合移植组（48/0.2 mm2）显著增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图3 心肌梗死边缘区毛细血管密度免疫组化检测

2.5联合移植改善金属蛋白酶及其抑制物平衡

采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测了胶原代谢中MMP-2、MMP-9以及TIMP-3的表达，采用明胶酶谱法检测了MMP-2、MMP-9活性。结果如图4所示：与对照组相比，联合移植组MMP-2 、MMP-9蛋白表达显著减少，而且酶活性分别下降68% （P=0.002 ）和64%（P=0.016），大网膜组和心耳组MMP-2以及MMP-9的表达和活性并未受到影响；此外蛋白免疫印迹法显示TIMP-3的表达在各组差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图4 四组金属蛋白酶及其抑制物表达的检测

3 讨论

在本研究中，我们通过观察大网膜包裹联合自体心耳组织块移植这种利用自体心肌组织进行心肌成形对慢性心肌梗死后大鼠心功能的影响，初步证实了该技术的安全性和有效性并对其可能的治疗机制进行初步探讨，主要研究包括：①大网膜包裹能够促进移植后心耳组织的存活；②大网膜包裹联合自体心耳组织块移植能够改善梗死后的心脏功能；③联合移植可能通过逆转心脏重构，其机制可能与改善MMP/TIMP平衡，促进局部血管新生有关。

在前期的一项研究中，我们应用大网膜包裹联合组织工程补片心肌成形技术治疗心肌梗死获得良好的疗效，但是这种以成体干细胞为种子细胞的组织工程心肌技术仍存在有自身无法解决的问题，如细胞存活率的结果显示在补片移植后4周，即便是经过网膜包裹细胞存活的百分比也不足4%；而且在心肌梗死区和周边区仅发现少量迁移的干细胞，这些干细胞分化方向尚不明确[3]。考虑到自身心房肌组织与心室肌组织在细胞成分和组织结构高度相似[4]，我们尝试裁取一定面积的左心耳组织移植至心肌梗死及边缘区，试图通过增加梗死区域具有收缩力的心肌成分改善心脏收缩功能。一般如果没有有效的血运支持，心肌组织将在40～60分钟内发生不可逆坏死，因此在本研究中我们将大网膜包裹技术联合应用，以期解决移植成体心肌组织的存活问题。选择大网膜的主要原因在于大网膜组织具有丰富的血管网络并能分泌大量的促血管生长因子而被广泛应用至各种缺血性疾病[5,6]，而且在冠状动脉旁路移植术发明之前，大网膜包裹心脏曾经作为主要的心肌再血管化方法应用于急性心肌梗死的治疗。

在我们的研究中，免疫组织化学方法证实了在移植部位的心肌梗死区域外侧含有肌钙蛋白-I阳性的心肌细胞，而在单纯心耳移植组移植区域未发现肌钙蛋白-I阳性的心肌细胞，初步证实大网膜包裹能够促进移植心耳组织的存活；不足的是，在本研究中，选取的心耳组织移植物来源于自身，缺少特异性的标记物，因此只能通过组织学研究证实左心耳的存活而不能对存活心肌组织进行定量分析。

心肌梗死激活各种细胞因子和蛋白酶进而引起心室重构，其中MMP/TIMP系统在其中发挥重要作用[7]。研究显示心肌梗死后以MMP-2和MMP-9为主的MMP家族的表达和功能显著增加，而TIMP表达明显下降，这种MMP/TIMP系统的失衡能促进正常细胞外基质的降解，促进心室重构的进展[8,9]。我们的研究结果显示联合移植能抑制MMP2和MMP9的表达，而且通过明胶酶谱法证实MMP2和MMP9活性分别下降68%和64%，虽然蛋白免疫印迹法提示联合移植并没有增加TIMP3的表达，但MMP2和MMP9活性下降显著的改善了MMP/ TIMP系统的失衡，抑制了心室重构,与既往研究结果相似[10-12]。在活体水平，我们通过超声心动图检查发现左心室舒张末径和收缩末径的缩小，证实了联合移植能显著限制心肌梗死后左心室的扩张，逆转心肌梗死后的心室重构；同时反映左心室收缩功能的射血分数和左心室短轴缩短率也有显著的改善，这些结果证实联合移植能逆转心室重构，改善心脏功能，而单纯的大网膜移植或左心耳并不能有效的改善慢性心肌梗死大鼠心脏功能和逆转其心室重构。

最后，在单纯大网膜移植组和联合移植组我们发现心肌梗死边缘区血管密度均明显增加，但由于缺乏组间差异，这种大网膜移植带来的保护作用似乎与心功能改善无明显相关，可能的解释是本研究采用的是慢性心肌梗死大鼠模型，与急性心肌梗死相比，慢性心肌梗死疤痕已经基本成熟，在梗死边缘区冬眠心肌数量较少，即使大网膜增加了梗死边缘区的血液供应，能恢复收缩功能的心肌细胞相对急性心肌梗死较少，因此改善心脏功能的作用并不明显[13, 14]。

本实验虽然证实了左心耳和大网膜联合移植能有效改善慢性心肌梗死大鼠心脏功能，但也存在不足之处。第一，本实验虽然证实了心耳的存活，而且通过组间对比证实了联合移植的有效性，但存活心耳是否与心室组织形成电机械整合本实验没有得到证实，即左心耳在改善心脏功能中所发挥的作用没有得到直接的解释；第二，联合移植虽然改善MMP/TIMP失衡以及下调内皮素-1的表达抑制了心室重构，但通过何种途径达到这种效果还需要进一步的研究。

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Effect of Omentopexy Combining Autologous Atrial Tissue Patch Cardiomyoplasty for Treating the Chronic Myocardial Infarction in Experimental Rats

HOU Jian-feng, ZHANG Chang-wei, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To explore the effect of omentopexy combining autologous atrial tissue patch cardiomyoplasty for treating the chronic myocardial infarction (MI) in experimental rats.Methods: The MI model of SD rats was established by left coronary artery ligation. 3 weeks later, the qualif i ed animals were randomized into 4 groups for the 2ndoperation.① Control group, the rats only received re-thoracotomy,② Atrial appendage group, the autologous atrial tissue patch was harvested from left atrial appendage of rats and transplanted to infarcted zone,③ Omentum group, the omentum of rats was transplanted to infarcted zone through diaphragm and④ Combination group, the left atrial appendage tissue and omentum were transplanted to infarcted zone together. 4 weeks after the 2ndoperation, the cardiac function was evaluated by echocardiography, the size and scar thickness of the infarction were examined by Masson staining, the survival of transplanted atrial tissue and angiogenesis were measured by immunohistochemistry, the protein expressions of VEGF, MMPs and TIMP-3 were examined by Western blot analysis, and the activities of MMPs wereidentif i ed by gelatin zymography.Results: 4 week after the 2ndoperation, transplanted left atrial appendage tissue only survived in Combination group. The areas of infarction were similar among different groups, P＞0.05. Compared with Control group, Combination group had the increased scar thickness (329 ± 33) μm vs (391±31) μm, improved LVEF (47.5 ± 4.5) % vs (57.9 ± 5.8) %, improved LVFS (20.7 ± 2.0) % vs (25.2 ± 3.6) %, all P＜0.05. Compared with Control group, both Omentum group and Combination group demonstrated higher density of angiogenesis at infracted area (33/0.2) mm2vs (49/0.2) mm2and (33/0.2) mm2vs (48/0.2) mm2, all P＜0.01. Combination group had decreased protein expressions of MMPs, while the expressions of TIMP-3 were similar among different groups, the activities of MMP-2 and MMP-9 were decreased by 68%, P=0.002 and 64%, P=0.016 respectively.Conclusion: Omentopexy could improve the angiogenesis and support the survival of transplanted autologous atrial tissue patch, therefore improve the cardiac function in experimental rats with chronic MI.

Myocardial infarction; Omentopexy

2014-08-04）

（编辑：漆利萍）

国家国际科技合作项目（2010DFA32620）；北京市科技新星计划（Z111107054511080）；协和青年科研基金项目（2013XHQN03）

100037 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室

侯剑峰 主治医师 博士 主要从事冠心病外科基础与临床研究 Email: hjf2006111@163.com 通讯作者：胡盛寿

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 12-1015-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.12.014

方法：前降支结扎法建立大鼠心肌梗死模型，3周后将筛选合格的模型动物随机分为4组：对照组，仅再次开胸；心耳组，开胸后裁取左心耳组织移植于心肌梗死及周边区；大网膜组：经膈肌将大网膜移植于心肌梗死及周边区；联合移植组：分别移植左心耳组织和大网膜。手术4周后，超声心动图评价心脏功能，Masson染色检测心肌梗死面积和疤痕厚度，免疫组化评价心耳存活、血管化，蛋白免疫印迹法检测血管内皮生长因子（VEGF）、金属蛋白酶（MMP-2/ MMP-9）及其抑制物（TIMP-3）蛋白表达，明胶酶谱法评价金属蛋白酶活性。

结果：4周后，左心耳组织仅在联合移植组存活。Masson染色显示各组心肌梗死面积差异无统计学意义 （P＞0.05），联合移植组疤痕厚度显著增厚（391±31）μm vs （329±33）μm， P＜0.05；超声心动图结果证实联合移植组心脏功能显著改善［左心室射血分数:（57.9±5.8）% vs （47.5±4.5）%， P＜0.05 和左心室短轴缩短率:（25.2±3.6）% vs （20.7±2.0）%，P＜0.05］；免疫组化结果显示大网膜组及联合移植组梗死周边区血管密度明显增加[（49/0.2 mm2vs 33/0.2 mm2and 48/0.2 mm2vs 33/0.2 mm2），P＜0.01]；蛋白免疫印迹法显示金属蛋白酶在联合移植组表达下降，金属蛋白酶抑制物表达差异无统计学意义，明胶酶谱法证实联合移植组金属蛋白酶活性下降（MMP-2: 68%， P=0.002; MMP-9: 64%， P=0.016），差异均有统计学意义。

结论：大网膜能通过增强血管化促进心房组织的存活，联合移植能通过改善胶原重构途径改善慢性心肌梗死大鼠心脏功能。