含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞凋亡的影响*

孟保英，张青，潘晓兰，王元祥，沈定荣，提运幸，马超，彭乐

含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞凋亡的影响*

孟保英，张青，潘晓兰，王元祥，沈定荣，提运幸，马超，彭乐

目的：探讨含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞凋亡及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达的影响。

先天性心脏病；乌司他丁；自体冷血停搏液；凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1011.)

心内直视手术中主动脉阻断后，心肌保护效果关系到术中及术后心功能的恢复，故在缺血期间加强心肌细胞保护，减轻再灌注损伤尤为重要，因此寻求与未成熟心肌生理功能相适应的保护措施，是国内外心脏外科关注的焦点。近年来，我中心开展婴幼儿心内直视手术应用自体冷血停搏液保护未成熟心肌的研究，已证实自体冷血停搏液对未成熟心肌保护优于冷血停博液和晶体停搏液，但是仍然发现存在不同程度的心肌损伤，我们在此基础上进一步探索，开展婴儿心内直视手术应用含乌司他丁自体冷血心脏停搏液，以期减轻心肌缺血－再灌注损伤。

1 资料与方法

选取2011-10至2012-08在我院收治的行体外循环室间隔缺损修补术患儿60例，其中男32例，女28例，年龄3～12月，平均年龄（3.5±0.4）个月，体重4.1～10.5 kg，平均体重（5.3±0.3）kg。随机分为含乌司他丁自体冷血心脏停搏液组（实验组）30例，男17例，女13例，及自体冷血心脏停搏液组（对照组） 30例，男15例，女15例。术前将所有患儿按照标准进行心功能分级[1]，均为心功能Ⅱ级，术前无肝肾功能异常、肺炎等合并症，末梢血象正常。（本研究符合作者所在单位人体实验伦理委员会所制定的伦理学标准，并取得患儿家属的知情同意。）

心脏停搏液制备：经医院伦理委员会讨论通过，并经监护人知情同意，实验组：体外循环开始前，将乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司生产，纯度为5000 U/kg）加入前期抽取制备的心脏停搏液中（晶体母液15 ml），经主动脉根部按血液：晶体4∶1比例快速抽取血液，K+浓度20 mmol/L，抽血时间约30～50秒，保持动脉收缩压≥40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），停搏液制备完毕后，经主动脉插管补充血容量以维持循环稳定，并将配制的心脏停博液浸入冰屑液中制成4℃冷停搏液备用。对照组：停跳液抽取及制备均与实验组相同，但不含乌司他丁。

麻醉与灌注方法及标本采集：二组患儿均全身麻醉及气管插管，采用JOSTRA人工心肺机，POLYSTAN膜式氧合器，全血预充，体外循环采用浅、中低温（25～32）℃，红细胞比积0.25～0.30。并行循环降温，阻断升主动脉，对照组经主动脉根部灌注4℃自体冷血心脏停搏液，实验组灌注含乌司他丁自体冷血心脏停搏液，首次剂量均为30 ml/kg，灌注压力50 mmHg，间隔40 min灌注一次，体外循环结束时进行改良超滤。分别于术前、主动脉开放后10 min分别取手术患儿右心房组织。所有患儿体外循环时间（35～75）min，平均（53.3±3.2）min，主动脉阻断（20～50）min，平均（32.5±5.2）min。手术由同一组医生、麻醉师、体外循环师合作完成。

dUTP缺口末端标记法（TUNEL法）检测心肌细胞凋亡：采用末端脱氧核糖核酸苷酸转移酶介导的TUNEL法检测细胞凋亡。按照福州迈新生物技术开发有限公司试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，蛋白激酶K消化，过氧化氢阻断，PBS液冲洗，TUNEL反应液37℃ 60 min，DAB/ H2O2显色（DAB为3,3二氨基联苯胺），苏木素复染，脱水、透明、封片。正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。每个标本观察4张切片，每张切片在光学显微镜400倍视野下分别随机选择5个工作区域，每个工作区域计数100个细胞，按公式计算：凋亡指数=凋亡细胞数/总观察细胞数×100%。

心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达测定（免疫组化检测）： 按照福州迈新生物技术开发有限公司试剂盒说明书进行。制备石蜡切片，石蜡切片经过二甲苯脱蜡（2次）、无水乙醇（2次）、95%乙醇及85%乙醇使组织再水化，进行抗原修复（Bcl-2蛋白采用柠檬酸组织抗原修复，Bax蛋白采用EDTA法进行抗原修复，严格按照说明书操作）。过氧化氢消除内源性过氧化物酶，加非特异性染色阻断剂，分别加一抗，4℃冰箱过夜，加酶标羊抗小鼠IgG聚合物，室温下孵育15 min。DAB显色，自来水冲洗后用苏木素复染，再用梯度乙醇和二甲苯脱水透明，中性树胶封片。阳性表达判断为镜下胞浆内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，计数每个高倍镜视野中100个细胞阳性细胞数，每张切片中采集5个视野，求出均值，得出阳性细胞百分率。应用GD-8型病理影像多媒体图文操作系统进行图像分析。

统计学分析： 使用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理。结果数据以均数±标准差表示，采用秩和检验及t检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组患儿体外循环情况

两组患儿的主动脉阻断时间、体外循环时间、自动复跳率及心室颤动发生率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。表1

表1 两组患儿体外循环情况（n=30 ,

表1 两组患儿体外循环情况（n=30 ,

注：对照组为自体冷血心脏停搏液组 实验组为含乌司他丁自体冷血心脏停搏液组

2.2两组患儿心肌细胞凋亡检测结果

体外循环前5 min两组心肌细胞凋亡指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。主动脉开放10 min两组心肌细胞凋亡指数较体外循环前5 min明显增加（P＜0.05），且实验组心肌凋亡指数较对照组明显降低（P＜0.05），差异均有统计学意义。表2

表2 两组心肌细胞凋亡指数检测结果（n=30 ,

表2 两组心肌细胞凋亡指数检测结果（n=30 ,

注：与对照组比较*P＜0.05；与本组体外循环前5 min比较△P＜0.05。余注见表1

时间 对照组 实验组体外循环前5 min 6.98±0.51 7.22±0.56主动脉开放10 min 23.47±3.01△ 13.56±2.28*△

2.3两组不同时点心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达比较

体外循环前5 min两组心肌细胞结构完整, Bcl-2蛋白与Bax蛋白轻度表达，两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。主动脉开放10 min两组心肌Bcl-2蛋白与Bax蛋白明显表达，较体外循环前5 min明显增加，且实验组心肌Bcl-2蛋白表达较对照组明显增加，实验组心肌Bax蛋白表达较对照组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达表现为细胞浆内有棕黄色着色。表3，图1、2

表3 两组不同时点Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达比较（n=30,%,

表3 两组不同时点Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达比较（n=30,%,

注：与对照组比较*P＜0.05；与本组体外循环前5min比较△P＜0.05。余注见表1

对照组 实验组Bcl-2蛋白表达体外循环前5 min 12.94±0.98 13.21±1.01主动脉开放10 min 40.17±3.54△ 68. 31±4.26*△Bax蛋白表达体外循环前5 min 8.93±0.91 8.25±0.88主动脉开放10 min 49.58±5.58△ 23.64±3.43*△

图1 免疫组化分析两组患儿右心房心肌细胞Bcl-2蛋白表达（×400）

图2 免疫组化分析两组患儿右心房心肌细胞Bax蛋白表达（×400）

2.4术后随访

两组患儿术后均存活，术后随访1月～2年，随访率100%，心功能均为I级与术前心功能均为Ⅱ级比差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

先天性心脏病是引起婴幼儿死亡的主要疾病之一，近年来尽管心脏外科技术发展迅速，但手术患儿日趋低龄、复杂、危重，心肌保护的不够完善仍是婴幼儿心脏术后心功能不全及住院病死率较高的重要原因[2]。自体血停搏液是我中心首创，抽取的自体血未接触体外循环管道，不含有活化的中性粒细胞、各种细胞因子、细胞毒素和氧自由基等，红细胞未被破坏，产生内源性氧自由基清除剂，对消除氧自由基等有害物质有一定作用。近年来，我中心开展婴幼儿心内直视手术应用冷自体血停搏液保护未成熟心肌的研究，已证实冷自体血停搏液对未成熟心肌保护优于冷血停博液和晶体停搏液，但是仍然存在不同程度的心肌损伤[3，4]。而研究表明乌司他丁对于消除自由基、防止心脏直视手术中心肌再灌注损伤有明显作用。故我中心采用乌司他丁及自体血配制停跳液，进行心内直视手术灌注停跳，以期减轻心肌缺血再灌注损伤及及心肌细胞凋亡。

乌司他丁是一种能够抑制多种蛋白水解酶活力的糖蛋白，能够同时抑制胰蛋白酶、NE、磷脂酶A2、透明蛋白酶等多种水解蛋白酶的活性；其代谢产物也具有很强的水解酶的抑制作用，可抑制炎症级联反应的多个环节，尤其可抑制黏附因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、白细胞介素-8及氧自由基等的释放，促进白细胞介素-10的释放。赵亚玲等[5]综述可能存在一种通过凋亡和炎症介导的心肌再灌注损伤。体外循环心脏直视手术心肌损伤主要是缺血－再灌注损伤，大量研究表明，缺血缺氧不仅导致心肌细胞的坏死，亦诱导心肌细胞凋亡；而细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的病理特征之一，且与心肌缺血再灌注损伤后的心律失常密切相关，亦与心肌重构、心肌顿抑及心力衰竭等病理机理密切相关[6,7]。李琛等[8]研究发现急性心肌梗死患者早期应用乌司他丁，通过降低血清白介素-6水平，升高白介素-10、超氧化物歧化酶水平，对缺血-再灌注心肌起到保护作用。阳世雄等研究发现体外循环中应用研究表明乌司他丁对于降低炎性介质白细胞介素-6和白细胞介素-8有明显作用，对于消除自由基、防止心脏直视手术中心肌再灌注损伤有明显作用。乌司他丁可在一定程度上抑制心肌组织细胞粘附因子-1（ICAM-1）表达上调，减轻炎症性反应，起到心肌保护作用[9-11]。杨明红等[12]研究表明含乌司他丁晶体心脏停搏液能够减轻心肌损伤，具有良好的心肌保护作用。综上所述采用乌司他丁及自体血配制停跳液，进行心内直视手术灌注停跳，以期减轻心肌缺血再灌注损伤及心肌细胞凋亡。

细胞凋亡是由基因控制的主动性死亡过程，机体内存在多条细胞凋亡的信号途径，其中“线粒体途径”是最重要的途径之一，Bcl-2家族蛋白是该途径的关键调节因子[13]。Bcl-2和Bax蛋白是该族的两个主要成员。Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜，起抗凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白则主要定位于细胞质，当细胞受到调亡因子的诱导便向线粒体转位。Bcl-2和Bax两者相互竞争，双相调节细胞凋亡。当Bax表达占优势时促进细胞凋亡，而Bcl-2表达占优势时则阻止细胞凋亡，因此学者将Bcl-2和Bax称为细胞的“死亡开关”[14,15]。

主动脉开放10 min两组心肌细胞凋亡指数较体外循环前明显增高，但乌司他丁自体血冷停搏液组心肌细胞凋亡指数较自体血冷停搏液组明显减低。主动脉开放10 min两组心肌Bcl-2及Bax蛋白表达较体外循环前5 min明显增加，且乌司他丁自体血冷停搏液组心肌Bcl-2蛋白表达较自体血冷停搏液组明显增加，自体血冷停搏液组心肌Bax蛋白表达较乌司他丁自体血冷停搏液组明显增加（P＜0.05）。以上结果可能是由于乌司他丁可抑制炎症级联反应的多个环节，能够消除自由基、减轻心脏直视手术中心肌再灌注损伤，使得心肌Bcl-2蛋白表达上调，下调Bax蛋白表达，可抑制体外循环心脏直视手术再灌注心肌细胞的凋亡，减轻心肌细胞损伤。故含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌保护作用可能通过减轻心肌细胞缺血再灌注损伤及抑制心肌细胞凋亡，从而减轻体外循环未成熟心肌细胞损伤，利于未成熟心肌保护。

通过本研究我们认为含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌保护效果明显优于自体冷血心脏停搏液，能够减轻心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤，利于术后心功能恢复，值得临床推广。

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Effect of Cold Self-blood Cardioplegia With Ulinastatin on Immature Myocardial Cell Apoptosis in Infant Patients

MENG Bao-ying, ZHANG Qing, PAN Xiao-lan, WANG Yuan-xiang, SHEN Ding-rong, TI Yun-xing, MA Chao, PENG Le.
Cardiovascular Center, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen (518038), Guangdong, China

ZHANG Qing, Email:szzhangqing@126.com

Objective: To investigate the effect of cold self-blood cardioplegia with ulinastatin on immature myocardial cell apoptosis and protein expressions of Bcl-2, Bax in ventricular septal defect (VSD) infants.Methods: A total of 60 infants received VSD repairing operation with cardiopulmonary bypass (CPB) in our hospital were summarized. The patients were randomly divided into 2 groups: Test group, the infants received cold self-blood cardioplegia with ulinastatin when aortic cross-clamp was closed. Control group, the infants received cold self-blood cardioplegia when aortic cross-clamp was closed. n=30 in each group. The right atrium tissue was collected before CPB and 10 min after releasing aortic cross-clamp. The index of myocardial cell apoptosis was observed by TUNEL method, and the protein expressions of Bcl-2, Bax were examined by immunohistological method.Results: Both groups showed the higher index of myocardial cell apoptosis at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB, and the apoptosis index in Test group was lower than that in Control group, all P＜0.05. The protein expressions of Bcl-2 and Bax were obviously increased at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB in both groups. Compared with Control group, Test group presented the higher Bcl-2 protein expression and lower Bax protein expression, all P＜0.05.Conclusion: Cold self-blood cardioplegia with ulinastatin could protect immature myocardum from ischemia-reperfusion injury in VSD infants during CPB operation in clinical practice.

Congenital heart disease; Ulinastatin; Self-blood Cardioplegia; Apoptosis

2014-04-30）

（编辑: 王宝茹）

本项目为深圳市科技计划资助项目（项目编号：201002115）

518038 广东省，深圳市儿童医院 心血管科

孟保英 主治医师 硕士研究生 主要从事体外循环直视手术心肌保护方面的研究 Email:szmengbaoying@163.com 通讯作者：张青

Email:szzhangqing@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1011-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.013

方法：选取在我院收治的行体外循环室间隔缺损修补术患儿60例，随机分成含乌司他丁冷血停搏液组（实验组，n=30）和自体冷血停搏液组（对照组，n=30）。分别于术前、主动脉开放后10 min分别取手术患儿右心房组织，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法观察心肌细胞凋亡情况，免疫组化检测Bcl-2及Bax蛋白表达。

结果：主动脉开放10 min两组心肌细胞凋亡指数较体外循环前5 min明显增加（P＜0.05），且实验组心肌凋亡指数较对照组明显降低（P＜0.05），差异均有统计学意义。主动脉开放10 min两组心肌Bcl-2 蛋白与Bax蛋白明显表达，较体外循环前5 min明显增加，且实验组心肌Bcl-2蛋白表达较对照组明显增加，实验组心肌Bax蛋白表达较对照组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论：含乌司他丁自体冷血停搏液对缺血再灌注心肌有保护作用，值得临床广泛推广。