人毛囊外毛根鞘无色素性黑素细胞与白癜风

袁 睿 综述，陈德宇 审校

白癜风是一种常见的原发性皮肤黏膜色素脱失症，我国报道的社区人群发病率为0.09%～3.10%［1］,通常临床上易诊难治。现有研究证实，人毛囊外毛根鞘有一类无黑色素且未活化的黑素细胞（melanocytes，MC）［2-3］。它是由起源于神经嵴的MC 在人胚胎2～5周向表皮、毛囊迁移中滞留于外毛根鞘转化来的。其不仅可为毛囊提供黑素母细胞，还可作为白癜风皮损区消失的MC 的主要来源。所以治疗白癜风的研究热点之一即为研究AMMC。现将其相关研究进展综述如下。

1 AMMC的生物学特征

CUI等［2］于20世纪90年代发现AMMC主要位于毛囊外毛根鞘的中上部，数量少，常聚集分布，一般情况下处于休眠状态，无黑素合成能力，属于未分化的黑素细胞。体外光镜下可观察到AMMC胞体一般小于黑素细胞，折光度好，呈多角形。多为双极，少数可为三级结构。原子力显微镜下可观察到AMMC胞体为长梭形，有2～3个极突，极突与胞体分界不清，每个极突无二级分支或侧枝，胞体与极突的侧缘有许多微绒毛样突起，向四周无规律伸展，形态各异。与表皮黑素细胞树突内充满单个或∕和聚集的黑素小体所不同的是，AMMC极突内未见清晰的颗粒状隆起，仅在核周见许多直径约300～500nm的黑素小体，多为Ⅱ、Ⅲ期，几乎无成熟的Ⅳ期黑素小体［4］。透射电镜下可观察到：AMMC 为圆形、或椭圆形，包膜上的突起短且稀疏。胞体中央可见一卵圆形核，占胞体的30%～50%，多有一个核仁。胞质内最明显的特点是含丰富的黑素小体，以Ⅱ、Ⅲ期为主，大小较为一致，均有单位膜包绕。线粒体多寡不一，仅于成熟黑素小体较多的细胞内可常见到。以上特征均体现了AMMC的不成熟性，因此AMMC 一般也不表达与黑素相关的酶分子，缺乏特异性分子标记［5］。所以可借助于NK1/beteb单抗和识别TYR,TRP1等联合识别AMMC。其原因在于NK1/beteb 可识别未成熟黑素小体上的gp-100。运用免疫组化的方法，用以上的单抗或多抗标记之后可以观察到：NK1/beteb 染色阳性细胞主要分布于生长期毛囊外毛根鞘中段，一般情况下均低于皮脂腺水平，数目较少，常群集分布。由于AMMC只表达前黑素小体相关抗原，这也证明了外毛根鞘功能的不成熟性［6］。

2 AMMC的培养

白癜风皮损区MC 缺失。再生的MC 来源于AMMC。如何刺激未成熟的且处于休眠状态的AMMC 增值、分化、移行，已成为当今关注的热点。但一直以来该细胞的分离与培养都被视为一难题，这也使得后续的研究无法继续。AMMC最早由Tobin［7］在1995 年以胶原酶法培养成功，但其方法很难去除成纤维细胞的污染且所使用的培养基促进了AMMC的成熟。近期Tobin 等再次改良了培养基成分，但培养出的AMMC 仍然可产生黑素。目前，王大光等［8］对AMMC 的分离培养纯化进行了最新的改良，并取得了成功，其方法如下：（1）与头皮提供者沟通获得同意后，记录基本信息后取头皮。（2）头皮经碘伏消毒5 min，用PBS 液冲洗数次。（3）以眼科剪剪去脂肪组织及真皮上1 mm。再将头皮剪成0.5 cm×1 cm 的皮片。（4）采用1%分离酶Ⅱ4℃消化24h，再37 ℃消化1h 后，眼科镊轻轻挤压使毛囊自动游离。用含5%小牛血清的DMEM 培养基冲洗3 次。（5）收集游离毛囊并切除毛乳头，离心后纯化毛囊。（6）0.5%胰蛋白酶37℃消化10～15 min 至外毛根鞘细胞大部分游离，血清终止消化，吹打形成细胞悬液后200 目铜网过滤，1500 r∕min离心5 min。（7）基础培养基为MCDB153、谷氨酰胺、2%胎牛血清、干细胞因子、内皮素、bFGF、双抗。将获取的细胞悬液以1×107个∕ml接种并培养于37 ℃、5%CO2的孵箱中。2d 后通过更换培养基来去除未贴壁细胞。7～8d 后按3：1 的比例第1 次传代。以后每5～7d 按1：2 比例传代。传至3 代即可获得纯化的AMMC。

3 AMMC与白癜风的治疗

白癜风的复色主要依赖于AMMC在各种因素的激活下分化并迁移到色素脱失处。现对实验及临床中常见的各种激活物作如下总结：（1）甲氧沙林（8-MOP）可以直接促进鼠黑素母细胞，鼠黑素瘤细胞合成黑素［9-10］。CUI 等［2］也曾采用甲氧沙林加长波紫外线（PUVA）治疗复色皮肤，治疗后人毛囊外毛根鞘出现了大量的多巴反应阳性的MC。目前最新研究以首次传代的AMMC 作为研究对象，经TYR、TRP-1和TRP-2 多克隆抗体研究间接免疫荧光标记，以含10、50、100umol/L 的甲氧沙林培养基培养可显示：经甲氧沙林作用3d 后AMMC 树突增多、延长、胞体变大，TYR表达量呈浓度依赖性增加，延长作用时间后TRP-1、TRP-2 表达也呈上升趋势［11］。这均可表明甲氧沙林参与AMMC的活化过程。（2）1,25二羟维生素D3（VID）临床上可运用于治疗白癜风，目前的研究表明其作用机制为：①使AMMC 细胞体积增大树突增长，形成具有多级树突和强折光性的细胞。②可促进AMMC 的络氨酸酶活性和黑素生成，并呈浓度依赖关系。③作用后可使AMMC 内黑素小体由Ⅰ、Ⅱ期向Ⅲ、Ⅳ大量转化，线粒体增多、扩张。④促进TYR、TRP-1表达增强。（3）糖皮质激素作为临床上最常用于治疗白癜风的药物，目前认为其作用机制主要作为免疫抑制剂直接作用于皮损以抑制白癜风皮肤中黑素细胞所受到的自身免疫的攻击［12］及促进黑素的合成，但并无明确的研究以证明以上观点。现已有学者使用倍他米松（BT）与AMMC共同孵育，其方法为：将传至2 代的AMMC 以105/cm2 接种于6 孔培养板中，24h 后加入浓度为103,106,109mol/L 的BT，作用72h后分析TYR、TRP-1、TRP-2的表达。通过这个实验他们课题组认为BT 可促进TYR、TRP-1 蛋白的表达并促进黑素小体的成熟，而TYR及TRP-1是MC成熟后合成黑素的关键酶。因此，可以推断糖皮质激素促进黑素生成主要是通过激活AMMC并促进其增值而产生黑素从而治疗白癜风的［13］。

综上可知，AMMC 作为未活化的黑素细胞受到各种刺激因素作用后激活、分化、成熟。之后可以移行到白癜风的白斑区产生黑素，进而治愈白癜风。这为我们进一步研究如何治疗白癜风提供了新的方向。

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