HPLC法测定复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的含量

陈锡龙

(贵州省兽药饲料监察所，贵阳550003)

《中华人民共和国兽药典》中复方磺胺对甲氧嘧啶片［1］中磺胺对甲氧嘧啶(C11H12N4O3)的含量测定采用的是永停滴定法，但是在应用实践中，发现该方法稳定性较差，主要原因可能是制剂中的辅料干扰了电极的敏感性，不能有效控制兽药复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的质量。本研究建立了复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法，并根据“兽药质量标准分析方法验证指导原则”对新建立方法的准确度、重复性、精密度、专属性、耐用性及线性等进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药 Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪(配紫外检测器);BP211D型电子分析天平(德国塞多利斯公司);超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器厂);磺胺对甲氧嘧啶钠对照品(Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批号:10228，含量:99.0%);试验样品复方磺胺对甲氧嘧啶片由某动物药业有限公司提供(批号为:201121001、20121101、20121201);磺胺对甲氧嘧啶原料(某兽药原料有限公司生产，批号:20130206);乙腈为色谱纯;水为高纯水;其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm);柱温为40℃;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20);流速为1.0 mL/min;检测波长为 270 nm［2］;进样体积为 10 μL。在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

图1 磺胺对甲氧嘧啶色谱图

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取磺胺对甲氧嘧啶钠对照品约54 mg(含磺胺对甲氧嘧啶约50 mg)，置50 mL量瓶中，加盐酸10 mL，超声处理5～10 min。取出，加水稀释至刻度，混匀，即得浓度为1.0 mg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照品贮备液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照品贮备液5 mL，置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得50 μg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取复方磺胺对甲氧嘧啶片20片，精密称定，研细。精密称取适量(约相当于磺胺对甲氧嘧啶0.2 g)置200 mL量瓶中，加盐酸10 mL，超声处理 5～10 min。取出，加水50 mL，再超声处理5～10 min。取出，加水稀释至刻度，过滤。精密量取5 mL滤液置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2 结果

2.1 线性范围 精密量取1.0 mg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照品贮备液 0.5、1、2、5、10 mL，分别置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得含磺胺对甲氧嘧啶浓度分别为 5.0、10、20、50、100 μg/mL的对照溶液系列。精密吸取各对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。磺胺对甲氧嘧啶浓度在5.0～100 μg/mL范围内，色谱峰有良好的线性关系，回归方程为Area＝33.56×Amt-12.15，相关系数大于0.999，标准曲线见图2。

图2 磺胺对甲氧嘧啶溶液的标准曲线

2.2 精密度 取企业提供的3批复方磺胺对甲氧嘧啶片样品各20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于磺胺对甲氧嘧啶0.2 g);另精密称取批号为20130206的磺胺对甲氧嘧啶原料药粉约0.25 g。样品和原料药均按1.2.3项进行制备成供试品溶液，每个批号作三个平行，每个样品进样2针，进行含量测定，以Zorbax SB C18为固定相，采用50 μg/mL的标准溶液进行单点定量(除非特别说明，均以Zorbax SB C18为固定相，并用50 μg/mL的标准溶液进行单点定量计算，下同)。以测定结果百分含量的相对标准偏差表示试验的精密度，精密度RSD分别为0.06、0.02、0.02和0.50，表明方法的精密度良好。结果见表1。

2.3 准确度 精密称取2.2中研细的批号为20121001复方磺胺对甲氧嘧啶片粉末适量，按高(H)、中(M)、低(L)三个浓度水平分别添加磺胺对甲氧嘧啶原料药粉(已知磺胺对甲氧嘧啶含量为89.50%)，制得向已知含量制剂中添加已知测定物的添加样品，每个浓度水平的添加样品分别制备3份供试样。按1.2.3项制成供试品溶液，进行含量测定。以磺胺对甲氧嘧啶的实际测定含量和理论含量(制剂中磺胺对甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值计算磺胺对甲氧嘧啶的回收率，结果见表2。结果表明，三个不同添加水平的磺胺对甲氧嘧啶的回收率均在97.9% ～100.6%之间，方法具有良好的回收率。

表1 精密度及含量测量结果

表2 准确度测量结果

2.4 耐用性 取按准确度测定项下制得的样品，保持流动相比例和流速不变，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色谱仪上分别使用Waters PHA C18(5 μm，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm)色谱柱，于40 ℃及15 ℃条件下进行测试，考察方法的耐用性，结果表明测量无显著差异，说明耐用性良好。

2.5 专属性 在样品测试色谱图中，标准出峰时间附近未发现明显的干扰峰，可见方法的专属性良好。

2.6 含量测定 方法同2.2精密度项，测量结果见表1。结果表明，批号为 20121001、20121101、20121201的三批企业样品的磺胺对甲氧嘧啶平均含量分别为53.01%、52.03%和53.06%，磺胺对甲氧嘧啶原料药粉中磺胺对甲氧嘧啶的平均含量为89.50%。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化。参考复方磺胺氯达嗪钠粉的含量测定、磺胺类药物残留检测方法及磺胺对甲氧嘧啶残留的检测方法可知，以前测量磺胺类药物的高效液相色谱法所使用的流动相系统有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)［1］、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)［3］、0.017 mol/L 磷酸 - 乙腈(80+20)［4］、磷酸盐溶液 - 甲醇(65+35)［5］等。采用流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)时，磺胺对甲氧嘧啶的出峰时间适当，峰形良好，且0.1%的磷酸溶液也容易配制。

3.2 样品提取方法的优化。在进行样品处理的过程中，分别采用10 mL盐酸、稀盐酸、0.4%的NaOH溶液溶解后，超声处理5～10 min，然后再加水定容。发现采用10 mL盐酸溶解后超声处理5～10 min，然后加入50 mL水再超声处理5～10 min，可以有效降低复方制剂中的辅料对磺胺对甲氧嘧啶的吸附，从而提高磺胺对甲氧嘧啶的回收率。

3.3 由于条件所限，在进行试验时因无法得到复方磺胺对甲氧嘧啶片制剂的所有原料，故采用制剂添加磺胺对甲氧嘧啶原料药粉的方法验证准确度，同时，采用实测含量与理论含量进行比较的方法确定磺胺对甲氧嘧啶的回收率，这样可以消除制剂中原有的磺胺对甲氧嘧啶对低水平添加回收率计算的影响。

3.4 高效液相色谱法还可以同时测定复方磺胺对甲氧嘧啶片中的甲氧苄啶，样品色谱图中保留时间约为4.2 min处的色谱峰即为甲氧苄啶，因篇幅所限，在此不再赘述。同时，样品色谱图中保留时间约为2.6 min处还有一个不明色谱峰，表明样品中还含有其他不明物质。

3.5 保持流动相比例和流速不变，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色谱仪上分别使用Waters PHA C18(5 μm ，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm ，4.6×250 mm)色谱柱于40℃及15℃条件下对样品进行测试，磺胺对甲氧嘧啶的保留时间有变化，但对测量结果无影响。

3.6 建立的复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法是可行的，各项方法学指标均比较理想，可以作为复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶质量控制标准。新方法采用高效液相色谱法测量复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的同时，还可以根据供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间是否一致对磺胺对甲氧嘧啶进行鉴别;现有方法采用永停滴定法测量磺胺对甲氧嘧啶的含量，虽然，永停滴定法使用的仪器设备比较简单，容易操作，维护成本比液相色谱仪低。但需要作硫酸铜沉淀反应鉴别其真伪，操作程序稍显繁琐，同时，永停滴定法的专属性也不如液相法佳。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(二部)［M］.二○一○年版.北京:中国农业出版社.

［2］查玉兵，陈 美，王晓芳，等。高效液相色谱法测定猪肉中五种磺胺类药物残留量［J］.分析仪器，2008，(4):44-45.

［3］中国兽医药品监察所.中国兽医药品监察所兽药残留检验操作规程CJCZ020［Z］.

［4］中华人民共和国农业部.农牧发［2001］38号文件［S］.

［5］耿士伟，曲 斌，姜加华，等.QuEChERS-UPLC-MS/MS快速测定鸡肝中七种磺胺类药物残留［J］.中国兽药杂志，2011，45(10):16-19.