RP-HPLC测定注射液中甲硫酸新斯的明含量

苏 亮，廖晓兵，何义刚，胡宇莉*

(1.重庆市兽药饲料检测所，重庆400120;2.waters科技(上海)有限公司，上海201206)

甲硫酸新斯的明是抗胆碱酯酶药之一，通过抑制胆碱酯酶活性而发挥完全拟胆碱作用，还直接激动骨骼肌终板上烟碱样受体［1］。甲硫酸新斯的明注射液在兽医临床上的应用较为广泛。首先，它抑制胆碱酯酶的活性而出现拟胆碱样作用，兴奋胃肠平滑肌，可增强胃肠蠕动，促进食欲和反当;其次，它对生殖系统的选择性兴奋作用较强，能兴奋子宫平滑肌，促进其中内容物的排出，故常用于母畜的子宫内膜炎、孕畜分娩困难、胎衣不下和和产后尿潴留等［2］;另外，甲硫酸新斯的明安全、副作用小，且来源广，价格较便宜。因此，它在兽医临床上有较好的实用价值。《中华人民共和国兽药典》二○一○年版一部采用氮测定法测定甲硫酸新斯的明注射液的含量，该方法过程繁琐，在实际检测中较为耗时，且容易产生误差。本试验建立了准确、简洁的RP-HPLC法对注射液中甲硫酸新斯的明含量进行测定。

1 仪器与试药

e2695-2489高效液相色谱仪(美国waters公司);empower2.0色谱工作站(美国waters公司);甲硫酸新斯的明对照品(中国食品药品检定所，批号:100550-200401，含量:100.0%);甲硫酸新斯的明注射液样品(批号:20130701，哈尔滨三马兽药业有限公司;批号:130801，重庆泰通动物药业有限公司;批号:20131001，四川恒通动物制药有限公司);甲醇为色谱纯，磷酸和三乙胺为分析纯，试验用水为milli-Q纯水机自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液和对照品溶液的制备 取甲硫酸新斯的明对照品约20 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为2 mg/mL的对照品储备液，置4℃保存。精密量取对照品储备液1 mL，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为40 μg/mL的对照品溶液。

2.2 波长选择 取甲硫酸新斯的明对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，得出260 nm为甲硫酸新斯的明的最大吸收波长。所以，选择260 nm作为该方法的测定波长。结果见图1。

图1 甲硫酸新斯的明的紫外光谱图

图2 空白(含辅料)溶液(A)、甲硫酸新斯的明对照品溶液(B)、甲硫酸新斯的明注射液样品(C)HPLC图

2.3 色谱条件 色谱柱:Thermo hypersil Gold-C18柱(美国 Thermo Fisher公司，4.6×150 mm，5 μm);流动相:0.1%磷酸水溶液(用三乙胺调pH至3.0)-甲醇(90∶10);流速1 mL/min;检测波长260 nm;柱温25 ℃;进样量 10 μL。

2.4 系统适用性和专属性试验 取空白辅料溶液、甲硫酸新斯的明对照品和样品溶液按2.3项条件测定，甲硫酸新斯的明对照品和样品溶液色谱峰的保留时间为7.48 min，理论塔板数不低于3000，拖尾因子小于1.02，空白辅料对测定无干扰，且相邻位置无其他干扰峰。结果表明，方法的系统适应性和专属性满足检测要求。结果见图2。

2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液0.1、0.5、2、5 mL 置100 mL 容量瓶中，1、2.5 mL 置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为 2、10、40、100、200、500 μg/mL 的系列对照品溶液。按2.3项下条件测定，以甲硫酸新斯的明的浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，得回归方程和回归系数分别为:y＝11041x+12912，R2＝0.9999。结果表明，甲硫酸新斯的明在2～500 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 定量限和检出限考察 分别精密量取甲硫酸新斯的明注射液(规格1 mg/mL)样品适量，加水逐级稀释，摇匀，得到浓度分别为 1、2、3、4、5 ng/mL的样品溶液，按2.3项条件测定。以S/N＝3、S/N＝10分别作为甲硫酸新斯的明的检出限和定量限判定标准，结果表明，本方法的检出限和定量限为分别为1 ng/mL和2 ng/mL。

2.7 样品含量测定方法 精密量取甲硫酸新斯的明注射液2 mL(规格1 mg/mL)，置50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。取该溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图;另取40 μg/mL的甲硫酸新斯的明对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。理论塔板数按甲硫酸新斯的明峰记应不低于3000。

2.8 精密度试验 取供试品溶液6份，按2.3项条件平行测定6次，得RSD＝0.5%。结果见表1。表明本方法精密度符合要求。

表1 甲硫酸新斯的明的精密度试验结果 n＝6

2.9 准确度试验 取适量的甲硫酸新斯的明对照品9份，精密称定(称样量分别为8.01 mg、8.01 mg、8.02 mg、10.01 mg、10.01 mg、10.01 mg、12.01 mg、12.01 mg、12.03 mg)，置 10 mL 容量瓶中。每3份一组，分别加入空白辅料溶液，稀释至刻度并摇匀，得到相当于注射液标示量的80%、100%、120%的样品溶液。按2.3项条件测定，计算回收率，结果见表2。结果显示，高中低浓度供试品溶液的平均回收率范围为100.2% ～100.8%，RSD范围为0.7% ～1.2%，表明本方法准确度符合要求。

2.10 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、3、6、10、12、24 h 迸样，按 2.3 项下条件测定其峰面积，计算峰面积的RSD值，RSD＝2.46%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.11 样品测定 分别精密量取甲硫酸新斯的明注射液2 mL，按2.7项方法操作，并按2.3项条件测定其含量。结果见表3。

表2 甲硫酸新斯的明的回收率结果

表3 样品含量测定结果n＝2

3 讨论与小结

3.1 《中华人民共和国兽药典》二○一○年版一部采用氮测定法测定注射液中甲硫酸新斯的明的含量［3］。该方法有以下缺陷:到达滴定终点时，消耗滴定液的量仅为2～3 mL，滴定液消耗体积过小是结果误差产生的重要来源;要求配备专用仪器半微量氮测定仪;检测过程长，仅消化一项就需要耗时2～3 h，若没有可调温消解仪，则消化过程更长更繁琐;注射液的药物含量低，终点时指示剂变色不明显［4］;另外，检测中使用到的检测试剂种类也比较多。高效液相色谱法用于兽药含量检测，具有较高的灵敏度和分离度，前处理过程也比较简单，检测周期较短。本试验所建立的方法中，样品仅用水稀释定容即可上机检测，且流动相易于配制。方法精密度RSD＝0.5%，平均回收率范围为100.2% ～100.8%，检测定量限达到2 ng/mL，样品主峰无杂质干扰。

3.2 在以往报道的液相方法中，检测甲硫酸新斯的明的流动相中多含有磷酸二氢盐及庚烷磺酸钠［5-6］。前者容易在液相流路中析出，造成堵塞和仪器部件磨损;后者会对C18柱造成不可逆的损伤。本试验中采用磷酸和三乙胺配制流动相，得到了满意的色谱峰形和重现性，克服了前述不足。同时，由于甲硫酸新斯的明分子易与C18柱的硅醇基相互作用形成拖尾，所以，调节流动相pH至3，可以抑制硅醇基的影响，减轻拖尾现象产生。另外，本试验使用了长度为150 mm的色谱柱，将主成分的出峰时间控制在10 min之内。与传统的250 mm色谱柱相比，短柱更加节约人工、时间和试剂。使用短柱或者从其他角度(比如使用小粒径的柱子)来提高兽药检测的分析效率，这一点在工作量日益增大的兽药检测实验室中，显得异常重要。

本试验所建立的RP-HPLC，准确、稳定、易于操作，可用于甲硫酸新斯的明注射液的质量控制。

［1］佟 玲，谭晓杰，陈晓辉，等.RP-HPLC测定明锌素滴眼剂中甲硫酸新斯的明的含量［J］.中国药学杂志，2005，40(15):1182-1183.

［2］郑四清.新斯的明在猪病临床中的应用［J］.兽医导刊，2009，(148):43-50.

［3］中国兽药药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版一部［S］.

［4］王 伟，孙为德.间接原子吸收光谱法测定甲基硫酸新斯的明［J］.分析试验，2003，22(4):62-63.

［5］岳昌林，毛黎静，郭 忠.RP-HPLC测定注射用甲硫酸新斯的明含量的方法学研究［J］.药物分析杂志，2005，25(10):1264-1265.

［6］唐琦文，江 峰，蒋国胜.高效液相色谱法测定复方新斯的明滴眼液中甲硫酸新斯的明的含量［J］.中国药师，2006，9(10):942-943.