荧光原位杂交技术在Y染色体微缺失患者中的应用

杜生荣，康跃凡，徐两蒲，黄海龙，郑备红，林典梁，孙 艳，陈文祯

荧光原位杂交技术在Y染色体微缺失患者中的应用

杜生荣1，康跃凡1，徐两蒲2，黄海龙2，郑备红1，林典梁1，孙 艳1，陈文祯1

目的探讨荧光原位杂交技术在Y染色体微缺失患者中的应用价值。方法辅助生育中借助显微操作系统，在卵裂期6～8细胞中活检1～2个细胞行荧光原位杂交，选择核型为46，XX的胚胎移植。结果在活检的11个胚胎中，染色体核型异常的2枚，46，XX的胚胎8枚，46，XY的胚胎1枚。移植核型46，XX的2枚胚胎获单胎妊娠出生正常女婴。结论对Y染色体微缺失的患者，通过胚胎植入前遗传学诊断选择女性胚胎移植，可有效阻断遗传性疾病传递给下一代。

Y染色体；胚胎移植；少精子症；原位杂交，荧光；植入前诊断

胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）技术是指通过体外受精获得胚胎，在胚胎培养第3d（6～8细胞）活检1～2个卵裂球或者囊胚期活检5～10个滋养层细胞，或取卵子极体活检，对其进行遗传分析（包括染色体分析和基因芯片分析）。PGD技术能诊断部分遗传性疾病，防止有遗传病的患儿出生。荧光原位杂交技术（flourescence in situ hybridization，FISH）主要用于染色体数目或结构异常（罗氏易位、平衡易位等）的诊断。男性不育症患者中，Y染色体微缺失检测示长臂无精子因子（azoospermia factor，AZF）与精子的发生密切相关，包括AZFa、AZFb、AZFc与AZFd区，AZF缺失患者可以导致无精子症、弱精子症或者重度少弱畸形精子症影响生育。这类患者可以借助卵胞浆单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术来实现妊娠，但是通过ICSI手段妊娠后，可能会把遗传性状传递给后代，给患者家庭带来精神和经济的负担。对这类Y染色体微缺失的患者可通过FISH技术选择女性胚胎移植，以阻断致病基因的遗传，实现优生的目的，笔者单位于2012年使用PGD技术成功诞生一健康女婴，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 患者女性，27岁，婚后3年未孕，月经规则，基础体温双相。宫腔正常，左侧输卵管通而不畅，右输卵管通畅。夫多次精液常规检查示：“重度少弱精子症”（精子计数1～2／10HP），染色体核型46，XY，Y 染色体微缺失，AZFd（sy152），AZFc（sy254，sy255）缺失。

1.2 方法

1.2.1 辅助生育与体外受精 采用常规GnRH－a长方案控制超排卵，监测卵泡发育成熟，肌肉注射HCG，36h取卵；收集好的卵母细胞去颗粒细胞、显微注射单精子入卵胞浆内，置37℃、体积分数为0.06的CO2培养箱培养。

1.2.2 胚胎活检 胚胎培养第3d选择6～8个细胞评分2级以上的卵裂期胚胎，用持卵针固定胚胎，激光在胚胎的透明带上打一个“V”形的口，活检针通过“V”形口吸取出1～2个卵裂球。

1.2.3 卵裂球固定 用金刚笔在干净的玻片背面作标记，将活检的单个卵裂球转移到0.1mol／L HCl／0.2%Tween-20低渗破膜2～3min，然后滴加甲醇／冰乙酸（3∶1）5min，干燥后杂交。

1.2.4 荧光原位杂交 70%的甲酰胺变性液73℃预温，将载有样品的玻片在变性液中变性5min，变性后将玻片放在70%、85%的冰乙醇中各1min，再转到100%的冰乙醇中放置3min，将配制好的探针（Vysis探针，上海基因公司）在变性液中变性5min，最后将探针加到放有卵裂球的区域，加盖玻片，用胶将玻片的四周封片。杂交后将玻片放在湿盒中37℃过夜。将2×SSC，0.1%NP40在37℃预温，将盖玻片揭开，在此液中洗30s，再转移到1×SSC，0.3%NP 40中洗2min，待玻片干后，加10μL的DAPI染色10min后，荧光显微镜下观察。

2 结 果

本实验总共活检11个胚胎，11个卵裂球，活检的每个卵裂球均编序号，1号胚胎，11号胚胎染色体异常（图1A）；6号胚胎染色体核型为46，XY（图1B），3，4，7号胚胎活检后未形成囊胚淘汰（表1）；2，5，8，9，10染色体为女性胚胎（图1C，D），新鲜周期移植2，8号胚胎未孕；1月后，解冻9，10号胚胎移植，移植后第14d测定血绒毛膜促性腺激素升高，妊娠7周B超检查提示为单胎，可见胚芽与原始胎心搏动，妊娠20周羊膜腔穿刺，胎儿羊水细胞G显带染色，染色体核型46，XX，患者继续妊娠至足月，于2013年6月2日顺利分娩一健康女婴。

表1 第3d新鲜胚胎活检Tab 1 The fresh embryo biopsied on the third day

图1 FISH荧光图片Fig 1 The images of FISH fluorescence

3 讨 论

世界卫生组织统计，育龄夫妇中不孕不育症约10%～15%，男性因素导致不育占50%，其中由于遗传因素导致不育的占30%，而Y染色体微缺失是引起男性不育的主要遗传因素。目前已知AZF的微缺失主要分布在Y染色体长臂AZFa、AZFb、AZFc与AZFd非重叠区域。研究证明：AZFa缺失导致唯支持细胞综合征，最终影响精子的发育；AZFb缺失的患者表现为精子成熟障碍，发育停滞在精母细胞阶段；AZFc缺失主要表现为少精子症；AZFb和AZFc同时缺失会导致无精子症，即使通过经皮穿刺附睾取精或者睾丸取精，都难以获得精子，患者只能通过供精人工受精（AID）完成生育；AZFc、AZFd缺失主要表现为重度少弱畸精子症，此类患者可行卵胞浆单精子注射，获得Y染色体AZFc微缺失基因垂直遗传的男性婴儿，后代可具有相同的遗传类型或者可能最终导致无精子症，丧失生育力［1－3］。日本学者对Y染色体微缺失患者经ICSI生育的一个家族进行随访，3个儿子中，2个儿子有着与其父同样遗传缺失，而另一个儿子遗传缺失的范围更广，说明Y染色体的微缺失通过辅助生殖手段遗传缺失的片段可能会变长［4－5］。为了避免这样遗传背景的延续，需要新的辅助手段，即胚胎植入前遗传学诊断技术，对Y染色体为微缺失的患者，通过PGD选择女性胚胎移植，获得正常女婴，可以解除不育夫妇的精神负担、经济负担，最终达到优生的目的。

本例为福建省第一例PGD试管婴儿成功病例，在成功之前，曾预实验了15个废弃胚胎，从预实验中笔者总结了些经验和教训：

3.1 卵裂球的固定 首先，活检胚胎前玻片须用无水乙醇擦洗，否则卵裂球很容易脱落，微小的疏忽也会导致全局的失败。其次，细胞固定不必常规经1%乙酸钠低渗处理，改为直接在磷酸缓冲液漂洗后，移至载玻片标定区域内的1～2μL 0.01%Tween-20／0.01mol／L HCl中［6］，待液体（尽量少）自然干燥，及时在倒置显微镜下观察细胞从膨胀，破裂到核游离，待细胞完全干燥后，再加入甲醇／冰醋酸除去残留细胞质。本研究预实验中，7枚胚胎活检后出现细胞核丢失，原因玻片没有经过处理或者单细胞移到Tween-20／HCl后没有及时在倒置显微镜镜观察，改良实验方法后8枚胚胎固定后均可见裸露的细胞核）。

3.2 准确寻找细胞核的位置 玻片中常出现自发荧光的物质，容易误判为细胞核。应先用低倍镜找到钻石笔画的小圈，再用细准焦螺旋微调，找到细胞核的位置，转换油镜时，注意镜头不要触碰盖玻片，根据不同颜色的激发光观察染色体。

除以上报道的已经出生的PGD试管婴儿外，笔者所在诊断中心总共对7例患者因染色体问题进行PGD，其中4例Y染色体微缺失，2例嵌合体，1例为平衡易位，羊水细胞均证实FISH结果准确，妊娠率为57.14%（4／7）。说明已完全掌握PGD技术，从胚胎活检，固定，FSIH检测，方法可靠，结果准确。

总之，FISH技术可以诊断男性Y染色体微缺失的疾病，也可诊断染色体疾病（包括数目和结构的畸变），选择正常的胚胎移植，可以降低染色体易位导致的反复自然流产率。通过FISH技术结合辅助生殖技术可以把产前诊断提早到孕前，避免遗传患儿的妊娠、流产与出生，达到优生优育目的，值得临床推广应用。

［1］Krausz C，Quintana-Murci L，McElreavey K.Prognostic value of Y deletion analysis：What is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysi［J］.HumReprod，2000，15（7）：1431-1434.

［2］高小燕，杨国锋，孙 燕，等.AZF微缺失与男性不育［J］.生殖与避孕，2006，26（5）：302-306.

［3］刘晓红，闫丽盈，乔 杰，等.Y染色体微缺失与辅助生殖技术关系的研究进展［J］.生殖与避孕，2013，1（33）42-47.

［4］朱晓斌，李 铮，郭安亮，等.Y染色体微缺失父子间垂直遗传分析［J］.中华医学遗传学杂志，2007，24（2）：203-205.

［5］Komori S，Kato H，Kobayashi S，etal.Transmission of Y chromosomal microdeletions from father to son through intracytoplasmic sperm injection［J］.JHumGenet，2002，47（9）：465-468.

［6］黄国宁，孙海翔，李 刚，等.体外受精-胚胎移植实验室技术［M］.北京：人民卫生出版社，2012：353-357.

（编辑：常志卫）

Application of Fluorescence in Stiu Hybridization Technique for Patients of Y-chromosome Microdeletion

DU Shengrong1，KANG Yuefan1，XU Liangpu2，HUANG Hailong2，ZHENG Beihong1，LIN Dianliang1，SUN Yan1，CHEN Wenzhen1
1.The Reproduction Medical Center of the Hospital for Women and Children of Fujian Province，Fuzhou 350001，China；
2.The Prenatal Diagnosis Center of the Hospital for Women and Children of Fujian Province，Fuzhou 350001，China

ObjectiveEstablishing aplatform to evaluate the value of fluorescence in stiu hybridization for detecting Y-chromosome microdeletion.MethodsOne or two biopsies from six to eight cells at the cleavage stage were used to perform the fluorescence in stiu hybridization. The embryo whose karyotype was 46，XX was transferred.. ResultsEleven embryos biopsies were observed，among which 8 were 46，XX，2were abnormal and only one was 46，XY. After two embryos of karyotype 46，XX were transferred，one healthy baby girl was born.Conclusions Fluorescence in stiu hybridization is effective in preventing the next generation from inheriting genetic defects and has crucial role in preimplantation genetic diagnosis.

mosome；embryo transfer；oligospermia；in situ hybridization，fluorescence；preimplantation diagnosis

R329.24；R392-33；R698.202

A

1672-4194（2014）01-0047-03

2013-12-07

福建省计划生育重点专科项目（闽财指20121589）；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目（2013-ZQN-ZD-6）

福建省妇幼保健院，福州 350001 1.生殖研究室；2.产前诊断中心

杜生荣（1982－），男，检验师，发育生物学硕士

康跃凡.Email：fjkyf＠163.com