重症监护室耐碳青酶烯类鲍曼不动杆菌的基因分型

郑培烝，邹 红，傅芬蕊，潘玉红，黄心宏，曹颖平

重症监护室耐碳青酶烯类鲍曼不动杆菌的基因分型

郑培烝，邹 红，傅芬蕊，潘玉红，黄心宏，曹颖平

目的了解笔者医院重症监护室（ICU）分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）的分子流行病学特点。方法收集2010年9月－2012年3月ICU分离的CRAB共34株，其中综合ICU 25株，烧伤ICU 9株，采用基于rep-PCR原理的DiversiLab系统进行基因分型分析。结果34株CRAB共分A、B、C和D 4型，烧伤ICU中存在A和D型，以A型为主且A型仅出现在烧伤ICU；综合ICU中存在B，C和D型，以D型为主且B和C型仅出现在综合ICU。结论烧伤ICU和综合ICU中流行的CRAB基因型不同。D型CRAB同时存在两个ICU中提示ICU间可能存在交叉感染。

鲍氏不动杆菌；不动杆菌感染；抗菌药；青霉属；碳；聚合酶链反应；基因；序列分析，DNA

鲍曼不动杆菌是一群不发酵糖类和氧化酶阴性的革兰阴性球杆菌。随着抗生素广泛应用所产生的选择性压力，目前鲍曼不动杆菌对现有几乎所有种类的抗生素的敏感性逐年下降，特别是对碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年上升越来越受到关注。耐碳青酶烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）是引起医院感染的常见病原菌之一［1］。对其进行分子流行病学监测对控制CRAB的传播，及早和准确地发现耐药菌株来源和确定传播方式至关重要。

基于DNA重复序列PCR（repetitive element PCR，rep-PCR）技术的DiversiLab分型系统具有操作简便、反应快速、重复性好等特点，其分型结果与脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）有较好的一致性，已成为医院感染分子流行病学研究的理想方法之一［2］。因此，本研究采用DiversiLab分型系统对CRAB菌株进行基因分型和同源性分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集笔者医院2010年9月—2012年3月间烧伤ICU和综合ICU分离到的CRAB，标本类型有痰、血液、尿液和胸腹水等。

1.2 仪器和试剂 全自动细菌鉴定仪（VITEKⅡCompact型，法国生物梅里埃公司）；生物分析仪（2100型，美国 Agilent公司）；药敏卡（批号：106197910，法国生物梅里埃公司）；超纯微生物DNA提取试剂盒（批号：BMX11A7，美国 MOBIO公司）；鲍曼不动杆菌rep-PCR分型试剂盒（批号：AC061201，法国生物梅里埃公司）；DiversiLab DNA芯片（批号：QC20RK01，法国生物梅里埃公司）。

1.3 菌种鉴定 所有CRAB菌株经全自动细菌鉴定仪鉴定，同时做42℃培养和氧化－发酵试验验证。使用药敏卡进行药敏试验，亚胺培南和／或美罗培南耐药的不动杆菌再通过K-B法验证是否对亚胺培南和／或美罗培南耐药。以上药敏结果根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2012年版的抗菌药物敏感性试验标准判断［3］。鉴定为鲍曼不动杆菌且亚胺培南和／或美罗培南耐药的菌株共34株。

1.4 基因分型

1.4.1 DNA提取 取MH平板上过夜培养的菌落用于DNA提取，按照超纯微生物DNA提取试剂盒操作说明书提取细菌基因组DNA，测定其OD260／280值，调整浓度在30～70mg／L之间。

1.4.2 rep-PCR 扩增 根据鲍曼不动杆菌rep－PCR分型试剂盒的要求，配制25μL PCR反应体系：重复序列PCR MMI 18μL，GeneAmp＠10×PCR缓冲液2.5μL，引物混合物2μL，AmpliTaq＠DNA聚合酶0.5μL，基因组DNA模板2μL。反应参数为预变性94℃2min→变性94℃30s→退火50℃30s→延伸70℃90s，共35个循环，70℃延伸3min。

1.4.3 PCR扩增产物检测 将PCR产物用配套的DiversiLab DNA芯片和生物分析仪检测。

1.4.4 结果分析 使用DiversiLab分型系统配套软件分析，得到各菌株相应的电泳图及进行同源性分析。

2 结 果

2.1 CRAB基因分型结果 共收集并确证CRAB标本34株，其中烧伤ICU 9株，综合ICU 25株。34株菌株显示A、B、C、D四个型别，其中A型7株，只出现在烧伤ICU；B型2株和C型1株，只出现在综合ICU；D型24株，烧伤ICU 2株和综合ICU 22株（图1）。

2.2 34株CRAB间同源性分析 不同菌株间的同源性用不同颜色来表示，深红色表示菌株间同源性为95%～100%，浅红色为90%～95%，蓝色为80%～90%，黄色为70%～80%，灰色则低于70%。从图中可看出各型CRAB的不同菌株间都有很好的同源性。A型和B型CRAB间的同源性较好，但与D型CRAB间的同源性较差（图2）。

3 讨 论

图2 34株ICU分离的CRAB同源性分析Fig 2 Homologous analysis of 34CRAB strains isolated from ICUs patients

鲍曼不动杆菌是引起医院感染的常见病原菌之一，特别是在ICU和血液科等特殊科室，主要导致呼吸机相关肺炎、伤口感染和败血症等疾病。CRAB往往表现出多重耐药的特性，它的出现和流行使得临床治疗变得十分困难，病死率较高［4］。为了控制CRAB传播，及早和准确地发现耐药菌株来源和型别鉴定十分重要。本研究通过基于rep-PCR的DiversiLab分型系统对34株临床分离的CRAB进行基因分型，将其分为4种基因型，说明这些菌株来源不同。烧伤ICU存在A型和D型CRAB，其中A型比例达到77.8%，说明A型是烧伤ICU中的流行株，而且A型仅出现在烧伤ICU不存在于综合ICU提示A型CRAB来源于烧伤ICU自身。在综合ICU中存在B、C和D型，其中D型占88.0%，说明D型是综合ICU的流行株。D型同时存在于烧伤ICU和综合ICU提示两个ICU间可能存在交叉感染。

引起ICU中CRAB流行的传染源主要来源于感染或定植CRAB的患者和环境中的CRAB，这就要求医务工作者增强医院感染的防控意识，重视手卫生，切断可能的传播途径，同时要注意环境的监测和消毒工作。发现CRAB感染的患者应及时采取隔离措施，防止感染的进一步爆发。

目前用于鲍曼不动杆菌的基因分型主要方法是PFGE。PFGE是公认的微生物分子分型方法的金标准［5］。但是PFGE操作复杂，所需时间长，不同实验室之间的可重复性较差，不利于不同实验室间的比较。DiversiLab分型系统是一款基于rep-PCR原理的微生物基因分型系统，可使样本准备、rep－PCR、电泳及结果分析能在短时间内完成，操作简单，重复性好。DiversiLab分型系统配套的分析软件是一款基于网络在线分析的软件，这为不同实验室间菌株的比对提供了便利，同时也为数据库的建立提供条件。通过比较笔者实验室和国内外其他实验室利用DiversiLab分型系统对CRAB进行基因分型的图谱［6－8］，发现笔者医院ICU中CRAB流行株的基因型和别的实验室不尽相同，提示不同地区流行的CRAB来源于不同的克隆株，同时也说明建立本地区CRAB监控平台的重要性。目前Diversi－Lab分型系统已广泛应用于鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、分枝杆菌属、念珠菌属和曲霉菌的基因分型，已被证明是微生物分子流行病学研究很好的平台［9－11］。

下阶段将在CRAB分子流行病学研究的基础上对其耐药分子机制和抗菌药物敏感试验进行系统研究，这将对指导临床合理使用抗生素、延缓耐药性的发生和发现新的耐药类型等方面有重要意义。

［1］Abbott I，Cerqueira G M，Bhuiyan S，etal.Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii：laboratory challenges，mechanistic insights and therapeutic strategies［J］.ExpertRevAnti InfectTher，2013，11（4）：395-409.

［2］Grisold A J，Zarfel G，Strenger V，etal.Use of automated repetitive-sequence-based PCR for rapid laboratory confirmation of nosocomial outbreaks［J］.JInfect，2010，60（1）：44-51.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenty-second informationalsupplement［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012：64.

［4］Maragakis L L，Perl T M.Acinetobacter baumannii：epidemiology，antimicrobial resistance，and treatment options［J］.ClinInfectDis，2008，46（8）：1254-1263.

［5］MacCannell D.Bacterial strain typing［J］.ClinLabMed，2013，33（3）：629-650.

［6］Higgins P G，Dammhayn C，Hackel M，etal.Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii［J］.JAntimicrobChemother，2010，65（2）：233-238.

［7］Yan Z Q，Shen D X，Cao J R，etal.Susceptibility patterns and molecular epidemiology of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strains from three military hospitals in China［J］.IntJAntimicrobAgents，2010，35（3）：269-273.

［8］谢红梅，胡必杰，陶黎黎，等.重症监护病房环境与临床分离耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的REP-PCR分型研究［J］.中华微生物与免疫学杂志，2011，31（10）：903-906.

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［10］Clarridge J E 3rd，Harrington A T，Roberts MC，etal.Impact of strain typing methods on assessment of relationship between paired nares and wound isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.JClinMicrobiol，2013，51（1）：224-231.

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（编辑：张慧茹）

Genotyping of Carbapenem-resistant Acinetobacter Baumannii Strains Isolated from Intensive Care Units

ZHENG Peizheng，ZOU Hong，FU Fenrui，PAN Yuhong，HUANG Xinhong，CAO Yingping
Department of Clinical Laboratory，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，China

ObjectiveTo investigate the molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii（CRAB）strains collected from intensive care units（ICUs）in our hospital.Methods34 CRAB strains were collected and isolated at ICUs of our hospital during the period of September 2010to April 2012，of which 25from general ICU，and 9from Burn ICU. Genotyping was performed by Diversilab repetitive element PCR system.. ResultsThere were 4types of CRAB strains，including type A，B，Cand D. Type A and D CRAB strains existed in Burn ICU Type A dominated. Type B，C and D CRAB strains were found in general ICU with Type D dominant.ConclusionThe epidemic strains of CRAB in Burn ICU was different from that in general ICU，and the type D CRAB strain appeared simultaneously in both the ICUs suggesting that a cross infection may prevail in the two ICUs.

Acinetobacter baumannii；Acinetobacter infections；anti-bacterial agents；penicillium；carbon；polymerase chain reaction；genes；sequence analysis，DNA

R378.7；R394.2；R978.1

A

1672-4194（2014）01-0057-03

2013-11-19

福建医科大学 附属协和医院检验科，福州 350001

郑培烝（1974－），男，主任技师，副教授，医学博士.Email：zhengpeizheng＠aliyun.com