鸡腹泻常见病原菌的分离与鉴定

詹先强 俞建萍 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

鸡腹泻常见病原菌的分离与鉴定

詹先强 俞建萍 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

为了深入了解当前鸡腹泻常见病原菌的种类及毒力等，本研究通过采集腹泻患鸡的病料，分别用细菌分离培养法、染色镜检法、动物试验和血清学方法进行分离与鉴定。试验结果表明：5株为鸡大肠杆菌、3株为肺炎双球菌、2株为链球菌、1株为鸡沙门氏菌，其中大肠杆菌、链球菌和肺炎双球菌均可使动物发病率高达100%。同时试验结果提示：50%（4/8）为混合感染，其余为单独感染。总之，目前引起鸡腹泻的主要病原菌为大肠杆菌、肺炎双球菌、链球菌、沙门氏菌等。本研究为养禽业有关鸡腹泻的正确诊断提供可靠依据，对该病的有效防控具有重要的理论指导意义和经济实用价值。

鸡腹泻 病原菌 分离 鉴定

近年来，随着养禽业的不断发展，鸡腹泻广泛发生于全国各地养禽场，并已然成为疾病防治中的一项重点研究对象。鸡腹泻是由多种病因引起的以排稀粪或水样粪便为特点的多种疾病的总称。生产实践证明，引起鸡腹泻的病原菌有多种［1-6］：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒菌和副伤寒菌、大肠杆菌、链球菌、李氏杆菌、耶氏菌等。由于病因复杂，常给该病的防治带来许多困难。为更好地了解该病的常见致病菌，为该病的防治提供可靠的条件和依据，从而指导和运用于养鸡生产以减少该病带来的经济损失，为此，笔者从福建省某发病鸡场随机抽检腹泻患鸡，对其临床观察和剖检的基础上，适当采集病料进行细菌学检测。

1 材料与方法

1.1 病料来源及有关情况 从福建省某发病鸡场随机抽取485日龄腹泻乌鸡8羽，均按正常标准饲养管理。患鸡消瘦，产蛋率下降，仅为正常的32%。其中有3羽鸡排绿色、白绿色或糖稀状粪便。对其进行解剖，发现有2羽鸡心脏颜色暗红，4羽鸡肝边缘出血，2羽鸡肾肿大，2羽鸡肺坏死。无菌操作采取病料心、肝、脾、肺、肾及小肠、大肠黏膜表面刮取物以备检验。

1.2 培养基 1%葡萄糖肉汤按常规方法［7］配制；麦康凯琼脂、改良马丁培养基由北京奥博星生物技术责任有限公司生产；营养琼脂、SS琼脂由杭州天和微生物试剂有限公司生产；伊红美蓝琼脂培养基由广东环凯微生物科技公司生产，以上培养基均按说明书配制使用；绵羊血平板培养基由本公司制备。

1.3 试验动物

1.3 .1 动物来源及饲养管理 ICR小鼠20只，体重18～20 g/只，雌雄各半，购自福州海王福药制药有限公司。按正常标准饲养管理观察3 d，均正常活泼。

1.3 .2 动物分组 将小鼠随机分为4个组，每组5只，其中3个试验组和1个对照组。

1.4 诊断血清及抗原 23种大肠杆菌O因子血清购自中国兽药监察所细菌室，型号分别为：O1、O2、O4、O5、O11、O15、O20、O21、O22、O23、O25、O26、O35、O53、O54、O68、O78、O109、O111、O119、O147、O148、O157，均在有效期内。鸡白痢-鸡伤寒多价平板凝集抗原购自北京中海动物保健科技公司。

2 试验方法

2.1 细菌分离培养染色镜检及纯培养

2.1.1 细菌分离培养、染色镜检 无菌采取病料分别接种于1%葡萄糖肉汤，置37℃培养24 h，然后从中勾菌分别在SS琼脂、麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上进行划线分离，置37℃培养24 h，观察分离菌菌落生长性状。选定可疑菌落分别划线于绵羊血平板上，置37℃培养48 h，分别观察细菌溶血现象。用分离到的可疑典型菌落分别抹片，进行革兰氏染色，油镜观察细菌形态。分离菌株编号与病料编号一致。

2.1 .2 增菌纯培养 选定单个可疑典型菌落，无菌操作分别接种于1%葡萄糖肉汤或改良马丁培养基，置37℃、24 h进行纯培养。

2.2 动物致病性试验 将已选定的可疑分离菌株肉汤纯培养物分别接种试验组小白鼠，每组（5只）接种1种分离菌，每只腹腔注射0.2 mL，对照组接种等量的肉汤培养基。注射后连同对照组连续观察7 d，记录发病情况。第7 d对所有的小白鼠进行剖解，观察病变，取其病料，抹片染色镜检，并分离培养，回收接种菌。

2.3 细菌血清学鉴定

2.3 .1 菌体O抗原的制备 分别将可疑分离菌株在普通琼脂平板上37℃、24 h进行培养，然后将培养物用少量0.5%石炭酸生理盐水冲洗，并分别收集于青霉素瓶中，包装后置121℃加热处理100 min。

2.3 .2 O因子血清平板凝集试验 用微量加样器分别吸取各种O因子血清50 uL置于洁净微量反应板上，然后再吸取已制备的菌体抗原进行混匀。若细菌抗原与相应血清作用，则3 min内出现明显凝集者为阳性反应，同时分离菌抗原需作抗原对照，应均无自凝现象。

3 结果

3.1 分离培养及染色镜检结果见表1。

表1 细菌分离培养及染色镜检

3.2 动物致病性试验 接种后2 h，15只小白鼠全部发病，扎堆、炸毛、精神沉郁、呼吸急促。连续观察7 d，所有试验组菌株均未使小白鼠死亡，对照组均正常。但攻毒前后对照组体重增幅明显高于试验组。对试验组所有小白鼠进行解剖观察，鸡大肠杆菌组有3只鼠肠道有大量气泡、黄色内容物，1只鼠肝表面有较多出血点、质地较脆，1只鼠脾脏色泽较浅；攻鸡链球菌组有3只鼠肝边缘稍发白，2只鼠肝表面有少量出血；攻鸡肺炎双球菌组有2只鼠肺发白，并且其中1只肺坏死，另有1只心肿大，1只有心包炎。对照组小白鼠经剖检无病变出现。剖检镜检观察从其肝脏中分别分离出的菌株形态与攻毒菌一致。发病情况统计结果见表2。

3.3 血清学鉴定结果 结果见表3。

大肠杆菌O因子血清凝集试验分离的5株鸡大肠杆菌均与鸡大肠杆菌O119因子血清发生快速凝集，强阳性，因此，可确定5个菌株血清型均为O119。

表2 分离菌动物致病性试验结果

表3 分离菌血清学鉴定结果

4 小结与讨论

4.1 小结 鸡腹泻主要病原性细菌为O119鸡大肠杆菌，其次为肺炎双球菌、鸡链球菌、鸡沙门氏菌等。

4.2 讨论

1）对细菌进行抹片染色、镜检、分离培养、动物致病性试验、O因子血清凝集试验鉴定，结果证实鸡腹泻主要由病原性细菌引起，其中5株O119型鸡大肠杆菌、3株肺炎双球菌、2株链球菌、1株鸡沙门氏菌。对于导致鸡腹泻的研究国内外已有许多报道，但对于乌鸡腹泻病原菌的混合感染研究报道极少，故本研究可为乌鸡腹泻的正确诊断提供重要依据。

2）动物致病性试验结果表明：鸡大肠杆菌、肺炎双球菌和链球菌接种试验动物均可导致发病。肠致死性大肠杆菌在十二指肠、空肠和回肠黏膜表面大量繁殖，黏附于微绒毛，导致刷状缘被破坏，微绒毛断裂，上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻［7-8］。禽链球菌病又称链球菌性败血症，是禽类的一种急性、败血性传染病，该病菌自1979年起有雏鸡链球菌病的报道［9］，该病在世界许多国家都有发生，多呈地方性流行，也常呈散发，严重时呈毁灭性流行。而肺炎双球菌会引起肺肿大、呼吸急促。多种病菌引起的鸡腹泻使养殖户受到经济损失。目前从临床发病的乌鸡来看，致病力相对较弱，主要表现为排稀便、精神不振、食欲下降，但菌株毒力不是很强，无死亡发生。但由于患鸡长期发生腹泻，造成的经济损失巨大，因此，应引起高度重视。

3）O因子血清鉴定结果表明，发病鸡场大肠杆菌的主要血清型为O119型，与参考文献报道基本吻合［10］。故建议各地在进行鸡大肠杆菌病的免疫预防时，所选疫苗的血清型一定要与当地流行菌株相吻合，最好选用当地分离株的自家菌苗，这样才能有效预防该病，否则会导致免疫效果不良或失败，给养鸡生产造成严重的经济损失。

4）本试验从病料中分离出了1株沙门氏菌，由于时间和条件所限，目前未能确定其血清型。有关其血清型和更多的生化试验内容均有待进一步深入研究。

［1］ 甘孟候.中国禽病学［M］.北京：中国农业出版社，2000：161.

［2］ 许兰菊，蒋媛媛，刘红英，等.鸡大肠杆菌的病原分离鉴定与药敏试验研究［J］.河南农业大学学报，2003，37（4）：392-395.

［3］ 许兰菊，臧为民，康相涛，等.鸡志贺氏菌病的病原鉴定［J］.畜牧兽医学报，2004，35（4）：420-423.

［4］ 许兰菊，王川庆，胡功政，等.鸡志贺氏菌病在我国的发现及其病原特性研究［J］.中国预防兽医学报，2004，26（4）：281-286.

［5］ 许兰菊，王川庆，马水锋，等.鸡志贺氏菌感染的血清流行病学调查［J］.中国兽医学报，2005，25（6）：594-596.

［6］ 杨峻，邵华斌，刘泽文，等.湖北省集约化鸡场成年产蛋鸡链球菌病诊治报告［J］.中国畜禽传染病，1998（增刊）：186-187.

［7］ 吴清民.兽医传染病学［M］.北京：中国农业出版社，2001：156-158.

［8］ 徐树强，杨安龙，吴兆林，等.扬州地区鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验［J］.江苏农业科学，2006（6）：330-332.

［9］ 施济人，贾守约.临床手册［M］.济南：山东科学技术出版社，1988：1038.

［10］ 蔡宝祥.人畜共患病学［M］.北京：农业出版社，1991：113.

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