放射性肺损伤中核因子κB和细胞间黏附分子1的表达及意义

张振勇，曹秋婷，吴荣

（1.中国医科大学附属盛京医院肿瘤科，沈阳110022；2.大连大学附属新华医院肿瘤科，辽宁大连116021）

放射性肺损伤中核因子κB和细胞间黏附分子1的表达及意义

张振勇1，曹秋婷2，吴荣1

（1.中国医科大学附属盛京医院肿瘤科，沈阳110022；2.大连大学附属新华医院肿瘤科，辽宁大连116021）

目的探讨放射性肺损伤中核因子κB（NF-κB）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达情况及其在放射性肺损伤发生发展过程中的作用机制。方法实验对象为Wistar大鼠，照射组接受X线照射（分为15 Gy照射组和20 Gy照射组），未照射组不接受照射。照射后饲养28 d，通过免疫组化法测定NF-κB和ICAM-1的表达，免疫组化染色利用计算机图像分析系统进行定量测定。结果NF-κB在未照射组少量表达，在15 Gy照射组和20 Gy照射组中表达均增强，与未照射组相比差异均有统计学意义（均P＜0.001），且2个照射组比较NF-κB表达的差异有统计学意义（P＜0.001）。未照射组ICAM-1几乎不表达，15 Gy照射组和20 Gy照射组与未照射组相比ICAM-1表达增强，差异均有统计学意义（均P＜0.001），但2个照射组比较ICAM-1表达无统计学差异（P＞0.05）。结论NF-κB和ICAM-1是导致急性放射性肺损伤的重要因素。通过减少NF-κB的活化调控ICAM-1的表达，可能减少放射性肺损伤，这为放射性肺损伤的预防和治疗可能提供新的治疗靶点。

核因子κB；细胞间黏附分子1；放射性肺损伤

放射治疗目前仍是治疗肿瘤的主要手段之一，应用放疗治疗胸部肿瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等时，正常的肺组织均会或多或少的受到一定剂量的照射而造成一定程度的放射性肺损伤，通常为降低这种放射性肺损伤的发生率，肿瘤靶区剂量会受到一定的影响。放射性肺损伤主要有放射性肺纤维化和放射性肺炎两种。但由于发生机制不明和治疗方法有限，放射性肺损伤成为胸部放疗的主要限制性因素，因此放射性肺损伤发病机制的研究及治疗靶点的探索具有重要意义。

研究显示，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种控制编码细胞因子、细胞黏附分子、疾病和

健康状态下一些基因表达的转录因子。越来越多的研究证据表明NF-κB极易被辐射激活，同时也显示着它与放射性损伤有着密切的关系［1］。细胞间黏附因子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是近年来在炎性反应过程中发现的细胞与细胞之间扮演中介角色的细胞因子，在放射性肺损伤过程中也担任非常重要的角色。本研究以大鼠接受不同剂量照射建立动物模型，观察NF-κB与ICAM-1在放射性肺损伤过程中的表达，为揭示放射性肺损伤的发病机制和治疗措施提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：健康雌性Wistar大鼠（SPF级）40只（由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心代购），月龄为3个月，体质量180～220 g。所有大鼠均饲养在中国医科大学附属盛京医院动物实验中心P3实验室屏障系统中，按照中国医科大学动物中心有关标准饲养、管理。

主要仪器、设备及试剂：彩色超声诊断仪EUB-8500（日本日立公司），医用直线加速器（德国西门子公司），光学显微镜BX50（日本OLYMPUS公司），病理图像分析仪HPIAS-100（西安华海电子有限公司），生物组织石蜡包埋机TEC-2800型（意大利郝思琳），石蜡切片机RY-2235（德国LEICA公司），二步法免疫组织化学检测试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司），NF-κB多克隆抗体（美国Santa Cruze公司），ICAM-1兔IgG多克隆抗体（即用型，博士德生物工程有限公司），免疫组化染色试剂盒（即用型SABC，博士德生物工程有限公司），DAB显色试剂盒（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组干预：将Wistar大鼠随机分成未照射组（10只）、15 Gy照射组（15只）和20 Gy照射组（15只）。照射组照射前用10%水合氯醛将大鼠进行腹腔麻醉（剂量0.3 mL/100 mg），在鼠板上仰卧固定，医用直线加速器调至10 MeV X线进行右全肺照射，单野，射野范围2 cm×2 cm，源皮距为100 cm，左胸及身体其余部位装置铅挡。照射后大鼠自然苏醒。未照射组仅麻醉。

1.2.2 标本的制备：大鼠照射后饲养28 d，最后存活的大鼠数量为未照射组10只、15 Gy照射组13只、20 Gy照射组12只，将大鼠断颈法处死，取右肺叶组织以甲醛固定，-80℃冰箱储存备用，48 h后将固定的组织放入70%乙醇溶液中。将保存在乙醇中的组织取出，取约10 g大小组织放入包埋盒中。在自动脱水机中脱水，完全脱水后经石蜡透明。然后放入制模铁片上，用石蜡机完全包埋、填充，静置于室温1 h，存贮于-20℃冰箱2 h后置于切片机上轻轻切片，将石蜡薄片浸于水中完全舒展后，置于烤箱中干燥1～2 h。

1.2.3 免疫组化染色：将切片脱蜡后用蒸馏水洗2 min再用PBS液洗3次，3%H2O2室温浸泡10 min后用PBS液洗3次，高压高温抗原修复10 min冷却，再用10%血清封闭30 min。待将血清甩掉，加第一抗体（1∶200稀释）1滴，4℃放置过夜。PBS液洗3次后加第二抗体1滴，室温放置30 min。继续用PBS液洗3次。加SABC 1滴，放置室温30 min。甩掉SABC后用PBS液洗3次。加DAB 1滴后置于显微镜下，见染色后继续用PBS液洗后用苏木素复染，流水返蓝后用梯度乙醇及二甲苯脱水，树胶封片。

1.2.4 光镜下观察结果：细胞质/核染成棕黄色或黄色为免疫组化阳性。每个实验组每个动物选取染色好的切片1张，随机在每张切片上选取视野7个，采用图像分析仪分别测定NF-κB及ICAM-1的平均光密度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NF-κB的表达情况

免疫组化染色发现，未照射组中细胞质/核染成黄色或棕黄色的细胞较少，提示NF-κB有少量表达；15 Gy照射组与20 Gy照射组可见大量细胞质/核染成棕黄色，提示NF-κB表达均增强。见图1。

2.2 NF-κB表达的定量测定

未照射组、15 Gy照射组、20 Gy照射组NF-κB光密度值分别为0.085±0.004、0.191±0.031、0.235± 0.009。15 Gy照射组、20 Gy照射组与未照射组相比，NF-κB光密度值的差异均有统计学意义（P＜0.001），并且2个照射组相比NF-κB光密度值也有统计学差异（P＜0.001）。

2.3 ICAM-1的表达情况

免疫组化染色发现，未照射组少有细胞质/核黄染，提示ICAM-1在正常肺泡组织中几乎不表达。

15 Gy照射组和20 Gy照射组可见细胞质/核染成棕黄色，提示ICAM-1表达均增强。见图2。

2.4 ICAM-1表达的定量测定

未照射组、15 Gy照射组、20 Gy照射组ICAM-1光密度值分别为0.085±0.004、0.230±0.019、0.234± 0.017。15 Gy照射组、20 Gy照射组与未照射组相比，ICAM-1光密度值的差异均有统计学意义（P＜0.001），但2个照射组相比ICAM-1光密度值无统计学差异（P＞0.05）。

图1 免疫组化染色检测各组大鼠NF⁃κB的表达×40Fig.1 NF⁃κB expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

图2 免疫组化染色检测各组大鼠ICAM⁃1的表达×40Fig.2 ICAM⁃1 expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

3 讨论

放射性肺损伤分为早期损伤和晚期损伤。美国放射肿瘤治疗协作组将发生在放疗开始后90 d内的放射损伤称为急性放射损伤，超过90 d发生的称为晚期放射损伤。早期放射性肺损伤主要为放射性肺炎，是一种由免疫介导的以淋巴细胞性肺泡炎为主的局部放射反应。晚期放射性肺损伤主要为放射性纤维化，是因靶细胞损伤后释放多种细胞因子，启动成纤维细胞进行增殖，导致胶原蛋白大量合成，最终使大量胶原沉积在肺间质［2］。研究显示，大鼠肺组织接受15～20 Gy剂量照射，8～12周后会产生放射性损伤的系列改变［3］，这些变化可能与受照体积、受照部位、放射剂量、放疗时间等都有关。放射肺损伤的机制研究开始于上世纪50年代，主要学说有肺泡上皮损伤、肺泡巨噬细胞生长因子、肺血管平滑肌损伤、淋巴管受累、免疫反应、巨细胞病毒参与等［4，5］。目前认为放射性肺损伤是一个复杂的病理生理过程，多种细胞因子在放射性肺炎和肺纤维化的发生发展中起调控作用。

近几年发现NF-κB是一个多功能核转录因子，生物学活性广泛，极易被激活，如肿瘤坏死因子α、免疫球蛋白G、射线、毒素等，激活后的NF-κB又可促进多种炎性介质如细胞因子、黏附分子、趋化因子等转录，并参与多种细胞因子、趋化因子和促纤维因子的合成，以及细胞外基质交联、成纤维细胞的分化和细胞增殖过程［6］，从而在炎性反应中发挥重要角色。NF-κB有5种不同的二聚体形式，不同的二聚体具有不同的结合序列，从而具有不同的功能特性［7］。在绝大多数静止期的细胞中，NF-κB以非活性形式存在于细胞质中，并可被许多刺激物所激活。现今越来越多的研究证据证明辐射可以激活NF-κB，这可能与放射性肺损伤关系密切，也可能刺激前炎性因子在放射性肺损伤过程中产生作用。Sherman等［8］、Brach等［9］研究先后显示了辐射可以激活TNF基因，进而在NF-κB的激活过程中起重要的作用。本研究中也显示，大鼠肺组织分别接受15 Gy、20 Gy放射线照射后，肺组织中的NF-κB被激活，较未照射组表达增多，表达水平存在统计学差异。Haase等［10］研究还显示照射剂量增大后的鼠肺中NF-κB的表达增高达6个月以上，因此认为这可能与后期的慢性炎症和间质细胞纤维化有关。

对肺间质纤维化的发病机制目前公认为：（1）早期各种外源性或内源性刺激引起大量炎性细胞聚集后渗出到肺泡腔、肺间质中，从而参与了肺损伤［11］；（2）其后炎性细胞和肺细胞分泌大量致纤维化因子，导致纤维组织增生，肺泡结构毁损。在这个过程中，不同细胞之间及细胞与基质之间的相互作用尤其重要，而黏附分子在它们中扮演着桥梁的角色［12］。黏附分子可以使细胞与细胞之间或细胞与基质之间更易于接触和结合，继而参与细胞的信号转导、生长等一系列重要病理生理过程。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，主要存在于肺组织的肺泡上皮和毛细血管内皮上，肺间质纤维化时，在炎性介质作用下，通过CD11/CD18-ICAM-1途径，可黏附白细胞使CD11/CD18表达上调，内皮细胞上ICAM-1表达亦上调［13］，故而能加重肺损伤。辐射可诱导肺血管内皮细胞产生ICAM-1，趋化白细胞黏附于内皮细胞，导致炎性反应。本研究结果提示，正常大鼠肺组织中ICAM-1表达呈阴性或弱阳性，接受照射后ICAM-1在肺组织中表达增强，但与剂量关系不大，即低剂量照射组与高剂量照射组之间光密度值无统计学差异。但这仍表明ICAM-1与肺损伤的炎性反应密切相关。目前，黏附因子参与肺纤维化的作用机制尚不明确。据免疫组化测定ICAM-1表达结果推测，ICAM-1可能参与肺间质纤维化形成。有研究利用博莱霉素建立大鼠肺纤维化模型［14］，并从中发现白细胞的累积水平与肺组织纤维化程度相关，而L-选择素、ICAM-1可介导白细胞聚集，进而调节炎性细胞因子的产生［15］。所以说ICAM-1在肺纤维化发展中的扮演着一个复杂的角色。

也有研究提示了某些组织中NF-κB活性的改变与ICAM-1表达相关［16］，在基础状态下少量NF-κB被刺激后激活，而ICAM-1的表达变化又与之同步。所以我们猜测，在放射性肺损伤中NF-κB很可能在基因转录水平上对ICAM-1的表达起着调控作用，从而影响其后的一系列炎症发展过程。虽然NF-κB对ICAM-1表达调控的具体机制还有待于进一步研究，但我们推测通过NF-κB抑制剂减少NF-κB的活化后，既可以减少NF-κB调控下的相关炎性反应，也可以调控ICAM-1的表达，以减轻肺泡炎性反应，进而减少肺组织损伤。这将是我们研究的新方向，给与此相关的疾病提供了一个新的治疗靶位。

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（编辑 陈姜）

Expression and Significance of Nuclear Factor-κBand Intercellular Adhesion Molecule-1 in Radiation-induced Lung Injury

ZHANGZhen-yong1，CAOQiu-ting2，WURong1
（1.Department of Medical Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China；2.Department of Oncology，Xinhua Hospital Affiliated Dalian University，Dalian 116021，China）

ObjectiveTo discuss the expression ofnuclearfactor-κB（NF-κB）and intercellularadhesion molecule-1（ICAM-1）in radiationinduced lung injury，and their mechanisms in the genesis and development of radiation-induced lung injury.MethodsWistar rats were used in the experiment.Rats in treatment groups received X-ray irradiation（15 Gy irradiation group and 20 Gy irradiation group），whereas those in the nonirradiated group did not.After28 days，NF-κB and ICAM-1 expression in the radioactive lung injury in rats was tested using immunohistochemistry，and immunohistochemicalstaining was quantitatively determined using the computerimage analysis system.ResultsNF-κBexpression in the nonirradiated group was a little，and itincreased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The difference in the NF-κB expression between the irradiated and non-irradiated groups was statistically significant（P＜0.001）；and that between the two irradiation groups was also statistically significant（P＜0.001）.ICAM-1 expression was little in the non-irradiated group；however，it increased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The differences in the ICAM-1 expression in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups were statistically significant compared with that in the non-irradiated group（P＜0.001）.However，the difference in ICAM-1 expression between the two irradiation groups were statistically non-significant（P＜0.05）.ConclusionNF-κB and ICAM-1 are the key factors that lead to acute radiation-induced lung injury.By reducing NF-κB activity and regulating ICAM-1 expression，radiation-induced lung injury can be reduced，which provides a new therapeutic targetforthe prevention and treatmentofradiation-induced lung injury.

nuclear factor-κB；intercellular adhesion molecule-1；radiation-induced lung injury

R818.74

A

0258-4646（2014）02-0155-04

张振勇（1977-），男，主治医师，硕士.通信作者：吴荣，E-mail：wur@sj-hospital.org

2013-11-13

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