防喘膏防治哮喘大鼠的疗效及其对血清IL-12、IL-13水平的影响

孙 红 杭州市红十字会医院儿科 杭州 310003

本研究建立哮喘大鼠模型，通过中药膏剂穴位敷贴治疗哮喘大鼠并与辅舒酮对比，探讨中药穴位敷贴防治支气管哮喘的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级SD大鼠32只，均为雄性，体质量（260±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016。SD 大鼠在屏障环境饲养，温度24℃，湿度60%，噪音85分贝以下，12h通风换气1次，每笼8只。

1.2 药 物 防喘膏制备：取麻黄、大黄、白芥子、地龙、细辛、甘遂（药物由浙江省中医院中药房提供），按比例研成粉末，同时以生姜汁调和成膏状；辅舒酮气雾剂（葛兰素史克集团公司，批号YJ0800）。

1.3 试剂与仪器 六水三氯化铝（中国上海枫泾化工厂，批号20080519）；氢氧化钠（杭州萧山化学试剂厂，批号 20080922）；卵清白蛋白（OVA，美国 Sigma公司Grand V，批号087K7004）；大鼠白介素-12 p70ELISA试剂盒（美国R&B公司，批号07270602）；大鼠白介素-13 ELISA试剂盒（美国R&B公司，批号07270701）；全自动酶标Bio-ELX800型（美国宝特）；超声雾化器402-A型（上海鱼跃医疗设备有限公司）；低温自动平衡离心机LDZ5-2型（上海医用离心机厂）。

2 实验方法

2.1 模型建立 32只雄性SD大鼠常规饲养7天后按完全随机分组分成正常对照组、哮喘模型组、防喘膏敷贴组、辅舒酮气雾剂组，每组8只。除正常对照组外，其余3组分别于造模第1天、第8天用新鲜配制的OVA1mg+氢氧化铝200mg+生理盐水1mL混悬液在大鼠两腹股沟、双侧胸部皮下，共4点做皮下注射，每点0.2mL，同时腹腔注射0.2mL。正常对照组以生理盐水代替OVA致敏。于实验第15天，将大鼠置于20cm×20cm×15cm大小的密闭容器中，以1%OVA进行雾化吸入激发，每次雾化30min,连续7天。正常对照组以生理盐水代替OVA激发。

2.2 分组用药 于实验第1天给药，用药敷贴前24h除辅舒酮气雾剂组，其余各组大鼠用儿童剪发器对其背部脱毛，脱毛范围约4cm×4cm大小，按邓春雷主编的《实验针灸学》[1]选取大鼠背部大椎、肺俞、膏肓、膈俞穴进行敷贴，具体给药：正常对照组给麝香镇痛膏敷贴，哮喘模型组给麝香镇痛膏敷贴，防喘膏敷贴组给防喘膏敷贴（3g/kg），隔天1次，每次3h，共7次。辅舒酮气雾剂组给喷雾辅舒酮喷雾（0.25mg/kg），隔天1次，共7次。实验中无动物死亡。

2.3 观察项目及检测指标

2.3.1 对哮喘大鼠引喘潜伏期的影响 观察OVA雾化吸入后哮喘大鼠的引喘潜伏期。

2.3.2 对哮喘大鼠血白介素-12（IL-12）的影响 末次雾化后采血5mL左右，在室温下静置30min后3500r/min离心15min，取上清液，密封至-20℃冰箱中保存待测，按照ELISA试剂盒说明进行操作。

2.3.3 对哮喘大鼠血白介素-13（IL-13）的影响 末次雾化后采血5mL左右，在室温下静置30min后3500r/min离心15min，取上清液，密封至-20℃冰箱中保存待测，按照ELISA试剂盒说明进行操作。

2.4 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，计量资料用均数±标准差（x±s） 表示，采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐性时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett T3检验，P＜0.05差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 防喘膏对哮喘大鼠潜伏期的影响 防喘膏敷贴组和辅舒酮气雾剂组的引喘潜伏期较哮喘模型组明显延长，与哮喘模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。防喘膏敷贴组与辅舒酮气雾剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组哮喘潜伏期比较（x±s）

3.2 防喘膏敷贴对哮喘大鼠血IL-12、IL-13的影响

哮喘模型组、防喘膏敷贴组和辅舒酮气雾剂组大鼠血清IL-12水平较正常对照组明显降低（P＜0.01）,防喘膏敷贴组和辅舒酮气雾剂组大鼠血清IL-12水平较哮喘模型组大鼠明显升高（P＜0.01），防喘膏敷贴组大鼠血清IL-12水平较辅舒酮气雾剂组略微降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

哮喘模型组大鼠血清IL-13水平较正常对照组、防喘膏敷贴组和辅舒酮气雾剂组明显升高（P＜0.01）,防喘膏敷贴组、辅舒酮气雾剂组与正常对照组大鼠血清IL-13水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），防喘膏敷贴组与辅舒酮气雾剂组大鼠比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-12、IL-13含量比较（x±s） pg/mL

4 讨 论

支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症。气道炎症的发生与免疫反应细胞及其炎症介质、细胞因子和黏附分子有密切相关。细胞因子网络紊乱主要由辅助性T细胞（Th）亚群失去平衡造成，也就是“Th1/Th2失衡学说”，Th细胞可分化为Th1和Th2两种类型，Th1细胞主要分泌IFN-γ等细胞因子，Th2细胞主要分泌IL-4和IL-5等细胞因子。哮喘患者存在Th亚群失衡现象，表现为Th1功能相对受抑制，Th2功能相对亢进[2]，儿童也不例外[3]。实验研究发现多种细胞因子都能影响Th1和Th2细胞之间的平衡，如 IL-5、IL-12、IL-13等。

IL-12是多活性的细胞因子，能调节Th1/Th2介导的免疫应答平衡。IL-12促进Th0细胞分化为Th1细胞，发挥协同刺激功能，通过IL-12与IL-12Rβ2链结合，经过JAK2/STAT4途径增加γ干扰素（IFN-γ）的产生，而IFN-γ又可反过来加强IL-12的作用，从而形成一个正反馈调节，加强Th1的应答反应。IL-12还可诱导多种细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM2CSF）、IL-2、IL-8和 IL-10等。同时 IL-12对Th2类因子如IL-13、IL-5、IL-4的产生具有抑制作用，抑制Th0细胞向Th2细胞克隆分化，抑制Th2型应答反应，降低B淋巴细胞过度合成IgE，并抑制Th2型细胞增生，减轻气道炎症反应[4]。哮喘时由于内源性IL-12表达不足，Th1反应低下而Th2反应增强，对Th2细胞分化的抑制减弱，使免疫系统向Th2方向偏移，Th1细胞因子分泌减低，出现Th1/Th2细胞因子网络失衡，在过敏原或病毒等内外因素的刺激下哮喘发生[5]。

IL-13诱导Th0向Th2分化、抑制Th0向Th1分化，并促进Th2类细胞因子IL-4、IL-13的表达，抑制Th1类细胞因子IL-12、IFN-γ的表达，是哮喘炎症过程中一个重要的调节因子，这种因子的过量产生能够诱导变态反应：能刺激B细胞的增殖和分化，促进B细胞合成和分泌免疫球蛋白E（IgE），参与炎性反应过程；促进内皮细胞黏附因子-1表达；促进嗜酸粒细胞趋化因子表达，从而加强对嗜酸粒细胞的趋化；激活成纤维细胞，使基质蛋白沉积失衡，从而诱导呼吸道高反应性形成及小呼吸道结构的重建[6-7]。研究证实，使用特异性抗体中和IL-13后可阻止哮喘的发生，还可减少相关炎症介质的产生[8]。

中医敷贴属于中医内病外治法之一，此法将中药方剂与中医辨证取穴相结合，促使药物经皮肤由表入里，循经络达到脏腑，达到化痰、降气、平喘作用，最终起到治疗目的的方法。清代吴师机认为中药敷贴疗法可使“皮肤隔而毛窍通，不见脏腑恰直达脏腑也”。穴位敷帖简便易行、不良反应少，尤其适用于治疗小儿支气管哮喘。

本实验采用大椎、双侧肺俞、膏肓、膈俞穴敷贴治疗，大椎为诸阳之会，具有双相调节作用，虚寒者能升提阳气，实热者能清热祛邪。肺俞为肺的背俞穴，与肺卫关系最为密切，能宣通肺气，清利化痰。膈俞、膏肓皆太阳经背部腧穴，配合肺俞疏通阳气。防喘膏由麻黄、大黄、白芥子、地龙、细辛、甘遂、生姜汁组成。药物大多为辛温之品，可温化寒饮，宣肺平喘。其中麻黄为治疗哮喘之要药，《神农本草经》中记载麻黄能“止咳逆上气”。近代研究，麻黄有抗过敏、抗病原体和抗炎、平喘、止咳、祛痰、强心等作用。地龙对哮喘有较强的药理活性，其平喘作用与抗炎、抗组胺和解痉有关。白芥子温肺利气豁痰，其提取物有祛痰抗炎及刺激皮肤调节神经的作用；甘遂温化伏饮、利水逐痰；细辛温肺化饮、宣通肺窍；生姜汁温肺通络。

本实验结果显示，防喘膏敷贴能提高SD哮喘大鼠血清IL-12水平，降低IL-13水平，延长哮喘大鼠引喘潜伏期，抑制炎症反应。

［1］邓春雷,殷克敬.实验针灸学［M］.北京：人民卫生出版社，1998：147.

［2］徐慧，申昆玲，殷菊，等.IL-12对小鼠哮喘模型Th亚群和气道炎症的影响［J］.临床儿科杂志，2008，26（9）：798-802.

［3］阳艳丽，潘玉琴，何帮顺，等.哮喘患儿外周血调节性T细胞和Th1/Th2的变化及其与哮喘病情的关系［J］.中国当代儿科杂志，2011，13（6）：482-486.

［4］杨小琼，甘仲霖，黄忠碧，等.哮喘患者IL-18、IL-12及IFN-水平的初步研究［J］.临床肺科杂志，2007，12（6）：574-575.

［5］张永梅，徐青，安肃英，等.支气管哮喘患儿急性发作期血清白细胞介素-25、12的变化及其意义［J］.实用儿科临床杂志，2008，23（16）：1262-1263.

［6］Ooi AT，Ram S，Kuo A，et al.Identification of an interleukin 13 induced epigenetic signature in allergic airway inflammation［J］.Am JTransl Res，2012，4（2）：219-228.

［7］宋爱玲，蔡累，李志奎.IL13：一个前景广阔的治疗支气管哮喘的靶位点［J］.中华哮喘杂志，2009，3（6）：447-450.

［8］Wegmann M，Hauber HP.Experimental approaches towards allergic asthma therapy-murine asthma models［J］.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov，2010，4（1）：37-53.