pH响应两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束制备、表征及对维生素D3的体外释放研究

黎文建，彭海龙，2，*，熊 华，宁方建，张建飞

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学化学工程系，江西南昌330031）

pH响应两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束制备、表征及对维生素D3的体外释放研究

黎文建1，彭海龙1，2，*，熊 华1，宁方建1，张建飞1

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学化学工程系，江西南昌330031）

以羧甲基壳聚糖、N，N-二甲基十六烷基叔胺以及丙烯酸为原料合成了一种新型的pH响应性两亲性纳米材料，利用FT-IR对其结构进行了表征。该纳米材料在水溶液中能够自发形成具有壳-核结构的纳米胶束，临界胶束浓度为95mg/L，不同pH条件下粒径分布有较大差异，表面Zeta电位均为正。以维生素D3为模型分子，测得其对VD3的包封率达到57.3%，同时考察了该纳米胶束包裹VD3在不同pH条件下的释放行为，结果显示在人工模拟胃液（SGF）中累积释放量最低（42.1%），人工模拟肠液（SIF）中最高（69.2%）。该纳米胶束的pH响应性行为表明其适宜作为VD3以及其他食品活性成分的潜在纳米生物活性载体。

羧甲基壳聚糖，pH响应性，胶束，维生素D3，体外释放

壳聚糖（chitosan）是甲壳素脱乙酰化的产物，是地球上总量仅次于纤维素的天然氨基碱性多糖[1]，由于其具有无毒、生物可降解、生物相容性等特性而被广泛应用于食品、医药等行业。然而壳聚糖的pKa为6.5，仅溶于弱酸性环境，这在一定程度上限制了其应用范围。近年来，许多研究人员对壳聚糖进行化学改性，拓宽了壳聚糖及其衍生物的应用范围，主要包括烷基化改性、醚化改性、酯化改性和季铵化改性[2-5]。两亲性壳聚糖是通过在壳聚糖的C-2位引入疏水基团、C-6位引入亲水基团而形成的壳聚糖衍生物，当其在水溶液中的浓度高于临界胶束浓度（critical micelle concentration）时，通过自主装机理，能够自发形成内部疏水、外部亲水的具有壳-核结构的纳米胶束，该胶束体系能够将疏水活性成分包覆于核内，而亲水外壳又起到保护和传输的作用，这对于解决食品中的一些难溶于水的功能活性成分在人体内的传递具有重要意义。维生素D3（VD3）是一种脂溶性维生素，主要是通过紫外线照射在皮肤合成的，VD3在控制钙的吸收、调节免疫系统以及胰岛素分泌等方面具有重要作用[6]。然而，VD3几乎不存在于无脂肪甚至低脂肪等日常饮食中，因此在对于追求零脂肪饮食的今天，很容易造成维生素缺乏症[7]，为了提高VD3的水溶性，Teng等[8]采用大豆蛋白交联羧甲基壳聚糖，该纳米粒子避免了化学有毒交联剂的使用，对VD3具有较高包封率，但是由于该纳米粒子的尺寸很大程度上取决于乳化剂的用量、溶剂种类等，且难以形成具有特定临界胶束浓度，在较大稀释条件下具有稳定结构的纳米粒子。因此，本文采用水溶性羧甲基壳聚糖合成了一种新型的两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束，以VD3为模型分子，考察了不同pH条件下的体外释放行为。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羧甲基壳聚糖（CMCs） 上海晶纯试剂有限公司；N，N-二甲基十六烷基叔胺 上海嶅稞实业有限公司；维生素D3（VD3，99%）、芘（98%） 上海阿拉丁试剂有限公司；过硫酸铵（APS） 北京索莱宝科技有限公司；丙烯酸、环氧氯丙烷、异丙醇、丙酮、乙醇 天津市大茂试剂厂。

磁力搅拌器、旋转蒸发仪 德国IKA仪器；SHB-3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；荧光分光光度计 日本日立；紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；THZ-82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；TGL-16C离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 pH敏感性两亲性壳聚糖衍生物的合成 两亲性壳聚糖衍生物（DCMCs）的合成：10mL移液管移取8.6mL N，N-二甲基十六烷基叔胺于250mL圆底烧瓶中，于磁力搅拌器上搅拌，控制温度为60℃，慢慢一滴一滴的加入7.5mL的环氧氯丙烷，密闭反应2h后，旋转蒸发除去残留的环氧氯丙烷，得到暗黄色蜡状固体。称取1.0g CMCs溶解在40mL异丙醇水溶液中（v/v=1∶3），置于250mL圆底烧瓶中于磁力搅拌器上搅拌30min，加热到50℃，将上述制得的黄色蜡状固体慢慢加入到CMCs溶液中，50℃密闭反应24h，所得液体产物用一定量的丙酮沉淀，过滤得到白色沉淀物，所得沉淀物用一定量的去离子水溶解，用截留分子量为8000～14000的透析带去离子水透析3d，每8h换水，冻干得到白色产物。

pH敏感性衍生物（DCMCs-PAA）的合成[9]：0.1g上述冻干产物溶解在50mL水中，随后加入75μL的丙烯酸单体，室温搅拌2h，N2除氧后，加入自由基引发剂APS（过硫酸铵）0.02g，在油浴上70℃搅拌反应2h。所得溶液用去离子水透析3d，每8h更换透析液，冷冻干燥得产品。

1.2.2 壳聚糖衍生物的傅里叶红外光谱测定 取一定量待测物质，KBr压片处理，在400～4000cm-1范围内利用红外光谱仪测定其红外图谱。

1.2.3 DCMCs-PAA临界胶束浓度（CMC）的测定 临界胶束浓度是两亲性物质在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度，在浓度小于CMC时，物质呈单体状态，而当浓度大于CMC时，借助于分子间、分子内、氢键等作用力能够自发形成胶束。

芘标准液的制备[10]：准确称量60.7mg芘，以10mL丙酮溶解，再量取0.5mL置于10mL容量瓶中，丙酮定容，取0.4mL，置于10mL容量瓶，丙酮定容，得芘标准液。

不同浓度DCMCs-PAA芘标准溶液的制备：将制备好的芘标准储备液，分别吸取0.1mL，置8个10mL刻度管中，N2吹干丙酮，将浓度分别为1.0×10-4、1.0× 10-3、5.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、1.0×10-1、5.0×10-1、1.0mg/mL的DCMCs-PAA溶液加入到上述8个刻度管中，即可得芘浓度为6.0×10-7mol/L的DCMCs-PAA芘标准溶液，超声分散30min，再65℃加热3h，静置12h后测定芘的荧光光谱，根据图谱中芘的特征发射峰的比值，依据数学方法进行拟合计算，确定DCMCs-PAA的CMC。激发波长设置为334nm，激发狭缝设置为5.0nm，发射狭缝设置为2.5nm，扫描范围360～460nm。

1.2.4 不同pH条件下DCMCs-PAA的Zeta电位与粒径分布测定 分别取10mg DCMC-PAA粉末溶于10mL人工模拟胃液（SGF，pH1.2）、10mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）和10mL人工模拟肠液（SIF，pH7.4），分别测定其Zeta电位与粒径分布。

1.2.5 透射电子显微镜观察（TEM） 取不同pH条件下的待测胶束溶液，稀释后，用微量取样器将胶束溶液滴加到铜网上，利用JEM-2010HR型透射电子显微镜观察并拍照。

1.2.6 DCMCs-PAA包覆VD3纳米胶束的包封率及体外释放 载VD3胶束的制备：取10mg VD3和30mg DCMCs-PAA溶于40mL乙醇中，10℃下暗处搅拌2h，再用去离子水透析24h，冷冻干燥得到DCMCs-PAA载VD3胶束粉末。

VD3-乙醇标准曲线的绘制：配制一系列浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35μg/mL的VD3-乙醇溶液，在265nm的条件下，利用紫外可见分光光度计测其吸光度，得到标准曲线。

包封率（EE）的测定：取1mg上述冻干的VD3胶束粉末溶于1mL乙醇中，12000r/min搅拌离心15min，取上清液稀释一定倍数后测其吸光度，包封率按下式计算：EE（%）=胶束包裹的VD3的量/最初使用的VD3的量×100

体外释放实验[11]：分别取10mL胶束溶液置于3个透析袋中，再将其分别放入90mL SGF、PBS、SIF缓冲溶液中，100r/min的速率下在37℃条件下恒温振荡，在设定的时间间隔内，分别取5mL透析液，在265nm条件下测其吸光度，根据VD3标准曲线计算对应的释放量，每次取完透析液后再补加入相同体积的释放介质，累积释放量按下式计算。

式中，mv为载药粉末中VD3的总量，V0是总释放体系的总体积（100mL），Cn代表第n次取样测定的VD3的浓度，Ve=5mL。

2 结果与分析

2.1 DCMCs-PAA的合成与表征

DCMCs-PAA的简要合成过程见图1，羧甲基壳聚糖的C-2位的-NH2具有很高活性，易与其他官能团发生反应。本实验首先利用N，N-二甲基十六烷基叔胺与环氧氯丙烷反应生成一种蜡状黄色中间产物，再与羧甲基壳聚糖发生反应生成两亲性壳聚糖衍生物，最后在APS的作用下与丙烯酸发生反应得到最终产物。图2为PAA、DCMCs和DCMCs-PAA的红外图谱，1453cm-1和1710cm-1的峰分别对应PAA的-CH2-的弯曲振动和羧酸基团中的C=O伸缩振动。2921cm-1和2852cm-1对应的峰为DCMCs中长链亚甲基的伸缩振动，721cm-1峰的出现证明DCMCs中季铵盐基团的引入，而在DCMCs-PAA中1723cm-1处相对于DCMCs中增强的吸收峰和1466cm-1的吸收峰分别表明PAA中羧酸基团和亚甲基基团的引入，相对于DCMCs图谱，DCMCs-PAA的其他特征峰未有明显变化。以上结果表明PAA成功嫁接到了DCMCs上。

图1 两亲性壳聚糖衍生物的合成过程Fig.1 The synthesis process of amphiphilic chitosan derivatives

图2 壳聚糖衍生物及聚丙烯酸的红外图谱Fig.2 FT-IR spectra of chitosan derivatives and PAA

2.2 临界胶束浓度（CMC）的测定

临界胶束浓度是衡量胶束稳定性的重要参数。本实验采用采用芘作为疏水荧光探针，芘对其周围微环境的极性非常敏感，当溶液中芘的浓度小于10-5mol/L时，在360～460nm范围利用荧光分光光度计可以测得芘的五重发射峰（图3），其中第一发射峰（I1，372）和第三发射峰（I3，383）的比值可以用来描述胶束溶液的特性，由图4可以看出，随着溶液中胶束浓度的增大，I1/I3的比值逐渐减小，当增加到一定浓度后基本没有变化，根据此变化，利用Boltzmann函数拟合，确定其突变点，过此突变点的公切线与高浓度时的水平切线的交点即为临界胶束浓度。本实验测得其CMC值为95mg/L，该值远远小于一些低分子表面活性剂的临界胶束浓度，比如SDS（十二烷基磺酸钠，CMC为2.3×103mg/L）。较低的CMC值保证了即使在较大的稀释情况下，胶束也能够保持其稳定性，这对于其用于活性分子载体方面具有重要意义。

图3 芘-胶束溶液的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectrum of pyrene incorporated into DCMCs-PAA micelle

图4 372nm与383nm荧光强度的比值随胶束浓度的变化Fig.4 The change of intensity ratio（I372/I383）versus the concentration of DCMCs-PAA values

2.3 Zeta电位、粒径分布及透射电镜

图5显示了不同pH条件下的DCMCs-PAA胶束的Zeta电位、粒径分布与放大105倍的透射电镜图。在PBS缓冲溶液（pH7.0）中，测得其Zeta电位为+35.3mV，平均粒径为134.4nm，TEM图片显示其具有良好的球形形态，部分粘连可能是因为TEM制样过程中水分的蒸发造成的。在SIF溶液（pH7.4）中，TEM图片显示，胶束形态变得不规准且出现了变形甚至降解的现象，这可能是因为在碱性环境中，胶束分子中氢键作用力变弱，同时-COO-间排斥力增强，再加上胶束表面电荷的降低（+23.9mV），最终使得胶束变得不规整，粒径增大（349.1nm）且分布不规整。相反，在SGF溶液（pH1.2）中，由于溶液中H+的作用，胶束分子间氢键增强，使得胶束更加稳定，而胶束表面电荷与H+的排斥力作用使胶束粒径变小（113.4nm），Zeta电位（44.1mV）增大。

2.4 DCMCs-PAA胶束包覆VD3的体外释放实验

图6为VD3溶解在乙醇中，在265nm处测得的吸收曲线，由图6可以看出，所绘制的标准曲线线性相关系数（R2）达到了0.9992，说明溶液的浓度基本与VD3的浓度成线性关系，可以根据VD3的吸光度计算体外释放实验中其释放情况。

图5 SIF，PBS和SGF中胶束的Zeta电位、粒径分布与透射电镜图（105×）Fig.5 The Zeta potential,size distribution and TEM of DCMCs-PAA micelle in SIF,PBS and SGF（105×）

图6 VD3-乙醇标准曲线Fig.6 The standard curve of VD3dissolved in ethanol

根据1.2.6的方法，测得包封率（EE）为57.3%，这与其他一些两亲性聚合物胶束包覆紫杉醇、阿霉素等抗癌药物的包封率接近[12-13]。图7为SIF、PBS和SGF溶液中DCMCs-PAA包覆VD3的体外释放曲线图，由图7可以看出，3个pH条件下，缓释曲线在最开始的5h内都存在突释现象，也称为释放的第一阶段，这是由于胶束表面吸附的一些游离VD3的释放。在之后的37h内，SIF、PBS和SGF中VD3的累积释放量达到稳定的69.2%、53.6%和42.1%，这个阶段为释放的第二阶段。持续释放对于维持体内VD3的浓度以及提高其生物活性具有重要意义。释放结果显示，在SIF溶液中VD3的释放速率最快、释放量最大，这可能是因为由于在碱性环境中，胶束分子间作用力的减弱以及表面电荷的变化，造成胶束的变形甚至解体，从而造成VD3的快速释放，这和2.3结果相一致；相反在SGF溶液中，由于胶束分子间作用力以及氢键的增强等因素，胶束变得更稳定，从而释放速率相对最低、释放量最小。胶束的上述pH响应性行为，对于控制活性成分的释放行为具有重要意义，而且由于人体的多种pH环境，对于控制活性成分的释放部位也具有一定的参考意义。

图7 载VD3胶束在不同pH条件下的体外释放曲线Fig.7 In vitro release of VD3-loaded DCMCs-PAA micelle in different pH

3 结论

本文首先合成了一种两亲性壳聚糖衍生物（DCMCs），然后再嫁接上一种pH敏感性材料聚丙烯酸（PAA）而成功制备了pH响应性DCMCs-PAA纳米胶束，该纳米胶束具有良好的球形，表面Zeta电位为正，粒径较小。将该纳米胶束包裹VD3后于3种pH条件下进行体外释放实验，结果显示VD3在SIF中具有最快释放速率以及最大释放量，PBS次之，SGF最小。结果表明DCMCs-PAA纳米胶束对VD3具有较高包封率，且对pH具有较强的响应性，适宜作为一些疏水性食品功能性成分的潜在纳米载体。

[1]Hoagland P D，Parris N.Chitosan/Pectin Laminated Films[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44：1915-1919.

[2]Wang Y，Yang X，Yang J，et al.Self-assembled nanoparticles of methotrexate conjugated O-carboxymethyl chitosan：Preparation，characterization and drug release behavior in vitro [J].Carbohydrate Polymers，2011，86：1665-1670.

[3]Mohamed N A，Sabaa M W，Ei-Ghandour A H，et al. Quaternized N-substituted carboxymethyl chitosan derivatives as antimicrobial agents[J].International Journal of Biological Macromolecules，2013，60：156-164.

[4]Peng H L，Xiong H，Li J H，et al.Methoxy poly（ethylene glycol）-grafted-chitosan based microcapsules：Synthesis，characterization and properties as a potential hydrophilic wall material for stabilization and controlled release of algal oil[J]. Journal of Food Engineering，2010，101：113-119.

[5]Zou A，Chen Y，Huo M，et al.In vivo studies of octreotidemodified N-octyl-O，N-carboxymethyl chitosan micelles loaded with doxorubicin fortumor-targeted delivery[J].Journalof Pharmaceutical Sciences，2013，102：126-135.

[6]Nazarian S，St Peter J V，Boston R C，et al.Vitamin D3supplementation improves insulin sensitivity in subjects with impaired fasting glucose[J].Translational Research，2011，158：276-281.

[7]Li Q，Liu C G，Huang Z H，et al.Preparation and Characterization of Nanoparticles Based on Hydrophobic Alginate Derivative as Carriers for Sustained Release of Vitamin D3[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：1962-1967.

[8]Teng Z，Luo Y C，Wang Q.Carboxymethyl chitosan-soy protein complex nanoparticles for the encapsulation and controlled release of vitamin D3[J].Food Chemistry，2013，141：524-532.

[9]Hsiao M H，Lin K H，Liu D M.Improved pH-responsive amphiphilic carboxymethyl-hexanoylchitosan-poly（acrylic acid）macromolecules for biomedical applications[J].Soft Matter，2013，9：2458-2466.

[10]陆国庆，郑江，郑新川，等.芘荧光探针法结合曲线拟合研究胆盐-磷脂混合纳米胶束的聚集行为[J].药物研究，2010，20（10）：21-23.

[11]Yang Y Q，Guo X D，Lin W J，et al.Amphiphilic copolymer brush with random pH-sensitive/hydrophobic structure：synthesis and self-assembled micelles for sustained drug delivery[J].Soft Matter，2012（8）：454-464.

[12]Liu J，Li H X，Jiang X Q，et al.Novel pH-sensitive chitosan-derived micelles loaded with paclitaxel[J].Carbohydrate Polymers，2010，82：432-439.

[13]Jin Y H，Hu H Y，Qiao M X，et al.pH-sensitive chitosanderived nanoparticles as doxorubicin carriers for effective antitumor activity：preparation and in vitro evaluation[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2012，94：184-191.

pH-responsive amphiphilic chitosan derivative-based nanomicelles：Preparation，characterization and in vitro release of Vitamin D3

LI Wen-jian1，PENG Hai-long1，2，*，XIONG Hua1，NING Fang-jian1，ZHANG Jian-fei1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Department of Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China）

A novel amphiphilic and pH-responsive nanomaterial was synthesized using carboxymethyl chitosan，N，N-dimethylhexadecylamine and acrylic acid.The structure property and critical micelle concentration of the nanomaterial was characterized.The material has the capability of forming core-shell micelles in aqueous solution with critical micelle concentration of 95mg/L.The micelles exhibited different size in diverse pH conditions，and the Zeta potential were all positive charged.Vitamin D3was used as a model molecule，and the results indicated that the solubility of VD3was improved with higher encapsulation efficiency（EE，57.3%）.The in vitro release of VD3from the micelle in different pH solution indicated that the VD3-loaded micelle has the highest accumulative release（69.2%）in simulated intestinal fluid（SIF），while the lowest（42.1%）in simulated gastric fluid（SGF）.This novel core-shell micelle might be a potential biological carrier for VD3or other bioactive food agents.

carboxymethyl chitosan；pH-responsive；micelle；Vitamin D3；in vitro release

TS218

A

1002-0306（2014）10-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.019

2013－09－13 *通讯联系人

黎文建（1988-），男，硕士研究生，研究方向：功能性食品。

国家自然科学基金委员会资助项目（21266020）；国家自然科学基金委员会资助项目（21201098）；食品科学与技术国家重点实验室专项（SKLF-ZZA-201305）。