以滤纸酶活力为指标优化解淀粉芽孢杆菌Tu-115菌株产纤维素酶液体发酵条件

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071001）

地球上每年通过光合作用产生约5×1010t的纤维素，采用生物酶法将纤维素降解成简单糖类，饲喂畜禽，可有效缓解“人畜争粮”的现象，将具有巨大的经济效益和社会价值，但是大面积应用需要消耗大量的纤维素酶。通过筛选产纤维素酶的优良菌株以及优化产纤维素酶的发酵工艺可有效提高纤维素酶产量，降低其应用成本。

鉴于芽孢杆菌增殖速度快、发酵周期短、适合大规模生产等优良生产特性，目前产纤维素酶芽孢杆菌的筛选及生产工艺的优化已成为发酵生产纤维素酶研究的热点。Kazemi[1]从伊朗Fars省的土壤中分离筛选得到了1株产纤维素酶的芽孢杆菌属菌株BCCS A3，采用响应面法对其培养基进行优化，利用发酵罐系统达到了较高的产纤维素酶水平（50.30 U/ml），发现碳源、氮源在该菌株产纤维素酶过程中起到关键作用。王全等[2]以牛粪为原料筛选出对纤维素具有显著降解活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株XN-13，酶活力达1 700 U/ml。张立静等[3]从菜地土壤、动物粪便、青贮饲料等样品中分离筛选出1株具有显著的纤维素降解能力的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）菌株T-7，其纤维素酶活力达1 678.89 U/ml，通过降解工艺的优化，最终以10亿活菌/kg的接种量接入玉米秸秆，添加2%蔗糖+2%尿素，在发酵8 d后对秸秆纤维素的降解率达40.34%。杨丽娜等[4]从腐烂秸秆与腐殖质土壤样品中筛选到1株纤维素酶活性高的芽孢杆菌属菌株NP29，该菌株在37℃、pH值7.0的条件下，发酵36 h后纤维素酶活性可达1.8 U/ml。孙宏等[5]采用Plackett-Burman设计研究8种培养因素对Z-4菌体生长的影响，经最陡爬坡试验和中心组合设计得到最佳培养条件，相应条件下Z-4细胞干质量浓度的最大值为5.39 g/l，较优化前提高23.48%。孟婷等[6]以水牛瘤胃内容物及粪便为材料，用羧甲基纤维素平板初筛及刚果红染色法复筛，筛选出1株高产纤维素酶的革兰氏阳性芽孢杆菌菌株CP-10；在1.0%麸皮、1.0%蛋白胨、初始pH值6.0、37℃的条件下，其产酶量最高，能够在6 h内崩解滤纸，羧甲基纤维素酶活（CMCase）可达16.8 U/ml。

本实验室在前期工作中得到1株高产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Tu-115，并对其最适产纤维素酶固体发酵条件进行了研究[7]，在最优发酵条件下，CMC酶和滤纸酶活力分别可达73.35 IU/g和64.06 IU/g。本研究以滤纸酶活力为指标，通过单因素和正交试验相结合的方法，考察培养基中碳源、氮源、起始pH值、装瓶量、温度、接种量、发酵时间等发酵条件对产酶能力的影响，对Tu-115菌株产纤维素酶液体发酵条件进行优化，以获得最优的液体发酵条件，为利用该菌株工业化生产纤维素酶奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器

ZHWY-2112B型双层摇床，上海智诚分析仪器有限公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机，上海安亭试验仪器总厂；MLS-3020型高压灭菌锅，SANYO公司；AIR TECH超净工作台，苏净集团安泰公司制造厂；DH5000AB电热恒温培养箱，宁波海曙赛征试验仪器厂；Adventurer电子天平，OHAUS USA；722-E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。

1.1.2 试验菌株

Tu-115菌株，由河北农业大学生命科学院制药工程系提供。

1.1.3 培养基及试剂

Mandel′s无机盐营养液、DNS试剂制备方法参照尚伟等(2012)[7]。

芽孢杆菌种子培养基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Man⁃del′s无机盐营养液100 ml，自然pH值。

1.2 试验方法

1.2.1 Tu-115菌株产纤维素酶活性的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定纤维素酶的滤纸酶活力。

葡萄糖浓度标准曲线的绘制方法参照尚伟等(2012)[7]。

摇床发酵培养后，取下锥形瓶后取1 ml发酵液加入EP管中，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为测定酶比活力用。测定方法参照尚伟等(2012)[7]。

每1 min催化滤纸水解生成1 μg葡萄糖的酶量为1个滤纸酶活力单位（U）。

1.2.2 Tu-115菌株种子液培养

将菌种用5 ml无菌蒸馏水从1支斜面培养基上冲洗下来，接种于装有种子培养基的三角瓶中，装瓶量为100 ml/250 ml。于180 r/min、37℃，摇床培养12 h后使用。

1.2.3 Tu-115菌株产纤维素酶的培养基组成及条件研究

每个试验均设3个平行，最后取平均值。

1.2.3.1 碳源对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

分别以葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉、羧甲基纤维素钠、玉米粉作为碳源，含量均为2.0 g；2.0 g蛋白胨为氮源；100 ml Mandel′s无机盐营养液，配制成6种不同碳源的发酵培养基。Tu-115菌株种子液培养12 h后，将2.0 ml种子液转入发酵培养基中，30℃条件下培养24 h，而后进行OD值测定。

1.2.3.2 氮源对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

根据上述试验确定碳源种类，称取2.0 g。分别以尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏和黄豆饼粉作为氮源，加入0.2 g。加入100 ml Mandel′s营养液，配制成8种不同的发酵培养基。Tu-115菌株种子液培养12 h后，将2.0 ml种子液转入发酵培养基中，30℃条件下培养24 h，而后进行OD值测定。

1.2.3.3 Tu-115菌株产纤维素酶发酵培养基组成正交试验

根据上述试验结果，称取碳源、氮源，用磷酸缓冲液调节Mandel′s营养液pH值，之后取100 ml营养液加入。Tu-115菌株种子液培养12 h后，将2.0 ml种子液转入发酵培养基中，30℃条件下培养24 h，而后进行OD值测定。利用L9（34）正交表设计试验进行发酵培养基的优化。

1.2.3.4 装瓶量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

根据上述试验结果，按50、75、100、125 ml分别加入在250 ml的三角瓶按优化出的培养基成分加入各培养基成分和Tu-115菌株种子液。Tu-115菌株种子液培养12 h后，将种子液转入发酵培养基中，于30℃条件下培养24 h，而后进行OD值测定。

1.2.3.5 温度对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

根据上述试验结果，称取适量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s营养液，配制成发酵液。Tu-115菌株种子液培养12 h后，将适量种子液转入发酵培养基中，分别在25、28、30、35、37℃温度环境中培养24 h，而后进行OD值测定。

1.2.3.6 接种量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

根据上述试验结果，称取适量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s营养液，配制成发酵培养基。Tu-115菌株种子液培养12 h后，分别加入种子液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，培养适当时间，而后进行OD值测定。

1.2.3.7 发酵时间对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

根据上述试验结果，称取适量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s营养液，配制成发酵液。Tu-115菌株种子液培养12 h后，按最优的体积比将种子液转入发酵培养基中，在最优的温度下培养，从发酵24 h开始，每隔24 h抽样进行酶活测定，直至120 h，而后进行OD值测定。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖浓度标准曲线的绘制及种子发酵液的酶活力测定

DNS法测定葡萄糖浓度的标准曲线，其回归方程为y=1.393 8x，线性相关系数R=0.999 3，线性关系良好。利用DNS法测定Tu-115菌株种子液的滤纸酶活力，为（26.40±3.28）U/ml。

2.2 培养基组成对Tu-115菌株产纤维素酶影响的测定

2.2.1 碳源对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

碳源种类对Tu-115菌株产纤维素酶的影响见图1。试验结果表明，Tu-115菌株利用不同的碳源生长，产生的纤维素酶量有很大差别，以葡萄糖为碳源时产酶量最高。故选择葡萄糖为最优碳源。

图1 碳源种类对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

2.2.2 氮源种类对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

氮源种类对Tu-115菌株产纤维素酶的影响见图2。结果表明，黄豆饼粉作为氮源时，滤纸酶活力最大，且黄豆饼粉价格便宜，故以黄豆饼粉作为最适氮源。

图2 氮源种类对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

2.2.3 Tu-115菌株产纤维素酶培养基组成正交试验

对发酵培养基组成正交试验结果（见表1）进行极差分析（见表2），可知各因素对产纤维素酶量的影响，从大到小依次为葡萄糖含量>黄豆饼粉含量>起始pH值，由各因素各水平的均值可知，培养基的最佳组成为：A2B3C2，即培养基的最佳组成为葡萄糖4%、黄豆饼粉3%、pH值4.0。

表1 Tu-115菌株产纤维素酶发酵培养基组成正交试验方案及结果

表2 Tu-115菌株产纤维素酶发酵培养基组成正交试验结果极差分析

2.2.4 装瓶量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

利用DNS法测定装瓶量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响，结果见图3。结果表明，当装瓶量为50 ml/250 ml时可获得最大产酶活力。

2.2.5 温度对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

利用DNS法测定温度对Tu-115菌株产纤维素酶的影响，结果见图4。结果表明，37℃时产酶活力最高。

2.2.6 接种量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

利用DNS法测定接种量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响，结果见图5。结果表明，接种量为4%时，产滤纸酶活力较高。故接种量选择4%。

图3 装瓶量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

图4 温度对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

图5 接种量对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

2.2.7 发酵时间对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

利用DNS法测定发酵时间对Tu-115菌株产纤维素酶的影响，结果见图6。结果表明，发酵72 h产酶活力最高，因此以72 h作为最适发酵时间。

图6 发酵时间对Tu-115菌株产纤维素酶的影响

3 结论与讨论

对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Tu-115的液体发酵培养条件进行了优化，当培养条件为葡萄糖4%、豆饼粉3%、接种量4%，培养基起始pH值4.0、接种量4%、装瓶量50 ml/250 ml，37℃发酵72 h时，发酵液中滤纸酶活力达到最高值，为3 309.90 U/ml；与种子发酵液中滤纸酶活力相比，提高了125倍，Tu-115菌株发酵产滤纸酶能力大大提高。

滤纸酶活力（FPase）是指以滤纸为底物来表征的纤维素酶总活力，反映的是纤维素酶组分协同作用的总效果，即FPase越高，纤维素酶总活力越高，故本研究以FPase作为评价指标可以较好地表征纤维素酶的总活力。Wang等[8]以FPase为指标，采用响应面法对Fomitopsis palustris菌株产纤维素酶能力进行优化，在最优条件下发酵，F.palustris菌株产FPase能力达到了较高的水平(130.45 FPU/ml)，但所需时间较长（8 d）。发酵时间长主要是由于霉菌的特性决定的，且霉菌不适合大规模深层发酵生产，不利于纤维素酶生产成本的较低。虽然Tu-115菌株产FPase能力稍低，但它作为解淀粉芽孢杆菌，适合大规模深层发酵生产，有利于较低纤维素酶生产成本。